Aislamiento y caracterización de bacteriófagos del suelo contra el deterioro de alimentos y bacterias patógenas transmitidas por alimentos

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 9282 (2023) Citar este artículo

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El deterioro microbiano de los alimentos y las enfermedades transmitidas por los alimentos son los principales desafíos de la industria alimentaria con respecto a la vida útil de los alimentos. Los métodos de conservación actuales se asocian frecuentemente con cambios en las características organolépticas y pérdida de nutrientes. Por esta razón, el bacteriófago ofrece un método natural alternativo como agente de biocontrol que puede reducir la contaminación bacteriana en los alimentos sin alterar las propiedades organolépticas. Este estudio se realizó para aislar y caracterizar bacteriófagos del suelo para controlar las bacterias que deterioran los alimentos, como Bacillus cereus y Bacillus subtilis, y las bacterias patógenas transmitidas por los alimentos, como Escherichia coli enterotoxigénica (ETEC) y E. coli enterohemorrágica (EHEC). El aislamiento se realizó mediante el método de ensayo de superposición de agar y se recuperaron los fagos BC-S1, BS-S2, ETEC-S3 y EHEC-S4. El rango de huéspedes de todos los fagos aislados tendía a ser estrecho y tenía una alta especificidad hacia las bacterias específicas. Se midió la eficacia del fago donde ETEC-S3 no mostró eficacia contra B. cereus y EHEC-S4 mostró baja eficacia contra E. coli enteropatógena (EPEC). Se realizó análisis morfológico para el fago BC-S1 y ETEC-S3 con Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM), y se demuestra que pertenece al orden Caudovirales. Los fagos BC-S1 y BS-S2 redujeron significativamente las bacterias huésped cuando se aplicaron a las muestras de arroz cocido y leche pasteurizada con miMOI de 0,1. Mientras que el fago ETEC-S3 a miMOI de 0,001 y el fago EHEC-S4 a miMOI de 1 también mostraron una reducción significativa cuando se aplicaron a muestras de carne de pollo y lechuga a temperaturas de almacenamiento de 4 °C y 28 °C. La mayor reducción bacteriana del 100 % se mostró con el fago BC-S1 en muestras de leche pasteurizada y una reducción de hasta el 96,06 % con el fago ETEC-S3 en muestras de carne de pollo a 28 °C de incubación.

La contaminación microbiana de los alimentos es una preocupación importante en la industria alimentaria. Los alimentos contaminados pueden contener una variedad de microbios, incluidas bacterias que pueden usar los alimentos como fuente de energía, sin causar deterioro de los alimentos ni enfermedades transmitidas por los alimentos1. El deterioro de los alimentos puede resultar en cualquier cambio en las características sensoriales de un producto que hace que los alimentos no sean deseables para el consumo. Una amplia variedad de subproductos metabólicos que causan mal olor, mal sabor, así como cambios de color y textura pueden conducir a la pérdida de alimentos, causando efectos económicos y ambientales considerables2. Bacilo sp. Los grupos, como Bacillus cereus y Bacillus subtilis, son bacterias formadoras de esporas cuyas esporas pueden sobrevivir a la alta temperatura de procesamiento. Se encuentra comúnmente en muchos alimentos en mal estado, como la cordura en el pan, la formación de baba en el arroz, también mal olor en la leche3,4. Aunque los alimentos en mal estado pueden ser seguros para comer, algunas bacterias pueden tener una patogenicidad que provoque enfermedades transmitidas por los alimentos. Uno de los principales patógenos involucrados en la enfermedad diarreica, que también puede causar la muerte, es la Escherichia coli diarreica (DEC) que se puede encontrar en el suelo y el agua, como ETEC y EHEC5.

Muchos factores de riesgo asociados con la contaminación bacteriana de los alimentos a menudo están relacionados con sus prácticas de procesamiento, preparación, almacenamiento y manipulación. Los métodos convencionales de conservación de alimentos, como la pasteurización, el procesamiento a alta presión, la irradiación y los agentes químicos o biológicos, se utilizan comúnmente para ayudar a mejorar la seguridad alimentaria. Sin embargo, esos tratamientos se asocian frecuentemente con cambios en las características organolépticas, pérdida de nutrientes y efectos secundarios que amenazan la toxicidad6,7. Además, incluso con la variedad de métodos disponibles, los brotes de origen alimentario todavía ocurren con relativa frecuencia8. Por esta razón, es necesario encontrar un método de conservación alternativo para controlar el deterioro de los alimentos.

Una técnica prometedora y segura que aborda varias deficiencias es el biocontrol de bacteriófagos. Este método utiliza bacteriófagos líticos para atacar específicamente las bacterias patógenas y eliminar o reducir significativamente sus niveles en los alimentos para mejorar la seguridad de los productos alimenticios. Los bacteriófagos son virus que lisan huéspedes bacterianos vivos. Este potencial lítico se ha explotado en los intentos de diseñar un enfoque antimicrobiano más natural para controlar las bacterias en las diversas etapas de la producción de alimentos9. Son altamente específicos para el huésped, seguros de consumir, relativamente económicos y no alteran las propiedades organolépticas de los alimentos10. Se pueden encontrar en casi todas partes donde existen bacterias vivas, como el suelo, lo que ofrece la posibilidad de aislarlas con fines terapéuticos. Por lo tanto, el uso de bacteriófagos como preservación natural alternativa es muy prometedor6,11. Sobre la base de estos antecedentes, este estudio tuvo como objetivo aislar y caracterizar los bacteriófagos del suelo para controlar el deterioro de los alimentos y las bacterias patógenas transmitidas por los alimentos, como B. cereus, B. subtilis, ETEC y EHEC.

El fago S1 de Bacillus cereus (BC-S1), el fago S2 de Bacillus subtilis (BS-S2), el fago S3 de ETEC (ETEC-S3) y el fago S4 de EHEC (EHEC-S4) se aislaron de diferentes muestras de suelo cerca de la eliminación de desechos orgánicos. Las placas claras formadas como resultado del ensayo de superposición de agar indicaron la lisis de bacterias por fago. La concentración de bacteriófagos aislados se midió mediante la determinación del título. El fago BC-S1 obtuvo el título más alto con un valor de 1,72 ± 0,31 × 1010 PFU/mL en comparación con el fago BS-S2 1,57 ± 0,92 × 109 PFU/mL, el fago ETEC-S3 8,24 ± 1,38 × 109 PFU/mL y también con fago EHEC-S4 con el valor de 1,26 ± 0,86 × 105 PFU/mL.

El rango de huéspedes de los bacteriófagos aislados se determinó utilizando B. cereus, B. subtilis, ETEC, EHEC, EPEC y Vibrio cholerae. La gama de huéspedes de bacteriófagos aislados se muestra en la Tabla 1. Además de su capacidad para lisar su célula huésped, el fago ETEC-S3 también mostró actividad lítica contra B. cereus y el fago EHEC-S4 mostró actividad lítica contra EPEC. Mientras que el fago BC-S1 y el fago BS-S2 demostraron que solo podían lisar su propio huésped. Realizaban una alta especificidad de huésped que no podía atacar a otras bacterias, incluso de las que pertenecían al mismo género.

Todos los fagos aislados mostraron actividad solo para infectar bacterias específicas, su huésped bacteriano. Sin embargo, también se encontró que el fago ETEC-S3 ataca de manera ineficiente a B. cereus con EOP inferior a 0.001, mientras que el fago EHEC-S4 también tuvo una baja eficiencia con EOP 0.001–0.2 contra EPEC (Tabla 2).

La MOI del bacteriófago se llevó a cabo en ocho concentraciones diferentes de 102 a 10–5. El control positivo mostró solo bacterias huésped sin agregar bacteriófagos, mientras que el control negativo mostró solo bacteriófagos sin agregar bacterias huésped. Según el resultado, la inhibición más alta para el fago BC-S1 (Fig. 1) y el fago BS-S2 (Fig. 2) se mostró para MOI 0.1. Mientras que ETEC-S3, MOI 0.01 al MOI 100 más alto puede inhibir ETEC sin crecimiento en las primeras 6 h de incubación, seguido por un nuevo crecimiento de ETEC. Por lo tanto, miMOI del fago ETEC-S3 fue 0,001, mientras que el gráfico no mostró crecimiento bacteriano de ETEC (Fig. 3). miMOI del fago EHEC-S4 fue 1, lo que podría inhibir el crecimiento de EHEC dentro de las 10 h de incubación. El crecimiento bacteriano disminuyó a medida que aumentaba la MOI (Fig. 4).

miMOI del bacteriófago BC-S1.

miMOI del bacteriófago BS-S2.

miMOI del bacteriófago ETEC-S3.

miMOI del bacteriófago EHEC-S4.

El bacteriófago BC-S1 y el fago ETEC-S3 se continuaron para la determinación de la morfología debido a sus actividades más altas utilizando microscopía electrónica de transmisión (TEM), como se muestra en la Fig. 5. El fago BC-S1 realizó una cabeza icosaédrica con un diámetro de aproximadamente 75 nm y aproximadamente 90 nm. cola contráctil. Mientras que el fago ETEC-S3 realizó una cabeza icosaédrica con un diámetro de aproximadamente 65 nm y una cola contráctil de aproximadamente 100 nm.

Morfología de bacteriófagos con TEM (a, BC-S1; b, ETEC-S3).

Cada bacteriófago fue probado por su capacidad para reducir el número de bacterias patógenas específicas en las muestras de alimentos. Los fagos BC-S1 y BS-S2 se aplicaron a arroz cocido y leche pasteurizada, mientras que los fagos ETEC-S3 y EHEC-S4 se aplicaron a carne de pollo y lechuga para ver el efecto de su aplicación en diferentes superficies y matrices alimentarias. La incubación se llevó a cabo durante la noche a temperatura de almacenamiento en refrigeración (4 °C) y temperatura ambiente (28 °C). Los resultados se muestran en la Tabla 3, donde todos los bacteriófagos aislados mostraron una reducción en todas las muestras y tratamientos. El mayor porcentaje de reducción por fagos BC-S1 y BS-S2 se encontró en muestras de leche pasteurizada, mientras que los fagos ETEC-S3 y EHEC-S4 mostraron la mayor reducción en muestras de carne de pollo a 28 °C de temperatura de almacenamiento.

Los bacteriófagos son la forma de vida más abundante en la tierra y se pueden encontrar en casi todos los hábitats, como el suelo, el agua y los alimentos. Se usó como muestra el suelo cerca de un vertedero de desechos orgánicos porque es una fuente ideal para aislar bacteriófagos ya que contiene un alto número de bacterias diversas. Por lo tanto, la presencia de sus bacteriófagos es potencial. Hay un estimado de 1,5 × 108 bacteriófagos por gramo de suelo agrícola12.

Se recuperaron con éxito cuatro bacteriófagos, a saber, el fago BC-S1 contra B. cereus, el fago BS-S2 contra B. subtilis, el fago ETEC-S3 contra ETEC y el fago EHEC-S4 contra EHEC. Estos fagos podrían considerarse bacteriófagos líticos debido a su clara formación de placas en el ensayo de superposición de agar. Sin embargo, en áreas donde los bacteriófagos están ausentes, las bacterias crecen hasta la fase estacionaria y forman una capa opaca confluente o "césped" en la cubierta de agar blando13. Algunos criterios requeridos para aplicar bacteriófagos como agentes de control biológico son obligatoriamente líticos, no transductores y libres de genes de toxinas para garantizar la seguridad14. Los bacteriófagos líticos se replican uniéndose, inyectando ácido nucleico y lisando la célula huésped para producir la progenie del fago. Los bacteriófagos "recién nacidos" están listos para comenzar otro ciclo al infectar otra célula bacteriana. Mientras están en el ciclo lisogénico, los fagos integran su ácido nucleico en el cromosoma de la célula huésped y se replican con él como una unidad sin destruir la célula15. Por lo tanto, los bacteriófagos deben ser obligatoriamente líticos para reducir la potencia de transferencia de genes de toxinas que pueden aumentar su virulencia16.

Conocer la concentración de los bacteriófagos aislados es fundamental. El título de bacteriófagos es uno de los factores que pueden afectar su eficacia en las aplicaciones de terapia con fagos. Un valor de título alto indica una mejor estabilidad del fago. Las aplicaciones de bacteriófagos para uso terapéutico requieren un alto título de fagos líticos (109 PFU/mL)17. En este estudio, el título de bacteriófagos aislados varió de 105 a 1010 UFP/mL. Se recomienda actualizar el bacteriófago regularmente para mantener la estabilidad del fago en un título alto porque el almacenamiento prolongado puede hacer que el título disminuya18.

La caracterización del bacteriófago mediante la determinación del rango de huéspedes también es un factor en la evaluación de la capacidad del fago aislado frente a diferentes cepas de bacterias huésped11. Se descubrió que el fago ETEC-S3 tiene la capacidad de infectar B. cereus, y el fago EHEC-S4 puede infectar EPEC, pero ambos mostraron una eficiencia baja. Todos los bacteriófagos aislados realizaron una gama de huéspedes muy específica o estrecha, incluido el fago BC-S1 o BS-S2, ya que mostró una alta actividad lítica solo para el huésped bacteriano, mientras que varias bacterias patógenas mostraron una baja eficacia y no mostraron actividad lítica en el huésped. otros, incluso más. Generalmente, los bacteriófagos recién aislados solo pueden infectar huéspedes con el mismo tipo de receptor general que el huésped aislado14. La ubicación de los receptores celulares varía según el fago y el huésped. Puede ubicarse en la pared celular, flagelos, pelos, cápsulas o proteínas de superficie en las células bacterianas. El fago no puede unirse a la célula huésped si los receptores son inaccesibles o no son complementarios a la proteína de unión al receptor del fago19. Otros estudios sugieren que es más probable que casi todos los bacteriófagos aislados utilizando una sola cepa de bacterias huésped tengan una gama de huéspedes estrecha en lugar de amplia. En muchos casos, esta estrecha propiedad es deseable porque normalmente tiene una gran especificidad para el huésped mismo, lo que evita la muerte de otras especies de bacterias y deja intacto el resto del huésped bacteriano. Este fago de gama estrecha de huéspedes también es esencial para el desarrollo de cócteles de fagos, lo que amplía la gama de huéspedes para la terapia con fagos. En este caso, es necesaria la caracterización del fago individual del cóctel14,20.

Se utilizó la eficiencia de la siembra (EOP) para definir la eficacia del bacteriófago contra las bacterias diana. Un valor de EOP de 0,5 a 1,0 se clasifica como de alta eficiencia, un valor de EOP de 0,2 a 0,5 se clasifica como de eficiencia media, mientras que un valor de EOP de 0,001 a 0,2 se clasifica como de baja eficiencia y un valor de EOP por debajo de 0,001 es ineficiente21. Según el resultado, el fago EHEC-S4 realizó una mayor eficiencia que el fago ETEC-S3. El fago ETEC-S3 se consideró ineficaz frente a B. cereus, mientras que el fago EHEC-S4 tuvo una eficacia baja frente a EPEC. Ambos fagos aislados mostraron alta especificidad ya que mostraron alta actividad solo contra hospedadores bacterianos. La EOP baja puede ser causada por la acción de los sistemas de resistencia del huésped que bloquean el desarrollo del virus intracelular o debido a la mala adsorción de bacteriófagos a las células huésped22.

La MOI se determina como la relación PFU/CFU, que cuenta solo los fagos adsorbidos adheridos a las bacterias y luego infectadas23. Es necesario examinar el valor mínimo de MOI para determinar la concentración efectiva potencial que se puede utilizar. En este estudio, todos los fagos aislados mostraron diferentes MOI óptimos para inhibir o lisar cada huésped por completo. El valor mínimo de MOI obtenido para el fago BC-S1 y BS-S2 fue 0,1, el MOI del fago ETEC-S3 fue 0,001 y el MOI del fago EHEC-S4 fue 1. El fago ETEC-S3 mostró el MOI más bajo en comparación con los demás. , lo que indica que el fago ETEC-S3 se considera más efectivo porque se necesita una concentración de fago más baja para reducir el número de bacterias. El valor de MOI efectivo se ve afectado por las condiciones ambientales, como la cantidad de fagos infectantes, la cantidad de células diana que se deben unir, y también la rapidez y el tiempo permitido para la unión12,23. Los fagos BC-S1, BS-S2 y EHEC-S4 dieron un mejor resultado en la actividad lítica usando números de MOI más altos. El crecimiento bacteriano disminuyó a medida que aumentaba la MOI porque un mayor uso de la MOI aumenta la probabilidad de que las partículas de fago infecten a la bacteria huésped. Un valor de MOI más bajo todavía mostró la reducción, aunque no pudo inhibir completamente el crecimiento del huésped bacteriano. Una mayor concentración de bacteriófagos significa que se pueden lisar más células, lo que produce una actividad lítica rápida24. Sin embargo, estos fagos diferían del fago ETEC-S3, en el que una MOI superior a 0,001 no podía inhibir completamente el crecimiento de las células. La reducción bacteriana se mostró en las primeras 6 h de incubación, y luego las bacterias continuaron creciendo nuevamente. La concentración de fagos que es demasiado alta en términos de MOI puede conducir a la lisis bacteriana a través de la acción enzimática de las lisinas de los fagos una vez que los fagos se unen a sus receptores, sin que los nuevos viriones accedan a la célula. De esta forma, se detiene la infección productiva de bacteriófagos, no generando más virus para invadir al resto de la población patógena25.

La clasificación de los bacteriófagos depende de su tipo de ácido nucleico y su morfología. Un bacteriófago está compuesto por una cabeza y una cola. La cabeza o cápside es una cubierta proteica que envuelve el material genético en forma de icosaedro. Las colas generalmente tienen seis fibras de cola que varían en tamaño y contienen receptores de proteínas para reconocer los sitios de unión en la superficie de las paredes celulares bacterianas para unirse a células huésped específicas26,27. Los bacteriófagos con cola (caudovirales) se dividen en cuatro familias según la forma de su cola (ICTV). Myoviridae tiene una cola larga, rígida y contráctil con una longitud de 80 a 485 nm, y el diámetro promedio de la cabeza es de 85 nm. Siphoviridae tiene una cola larga y flexible no contráctil con una longitud de 79 a 535 nm y un diámetro de cabeza promedio de 55 nm. Podoviridae tiene una cola corta no contráctil por debajo de 40 nm de longitud y un diámetro de cabeza promedio de 58 nm28. Además, el recién creado Ackermannviridae tiene hasta cuatro proteínas de espiga en la cola y puede infectar una amplia gama de bacterias Gram-negativas29. En este estudio, se analizó la morfología del bacteriófago BC-S1 y ETEC-S3 aislado mediante TEM. Según el resultado, ambos fagos mostraron una cabeza icosaédrica unida a una cola contráctil. Se puede suponer que ambos fagos pertenecen al miembro del orden Caudovirales. Se requiere un análisis molecular del genoma del bacteriófago para futuras investigaciones para conocer la clasificación específica y garantizar que estos fagos no contengan ningún gen asociado a la virulencia, así como genes de resistencia a los antibióticos30.

Dado que los bacteriófagos causan la muerte bacteriana, su uso potencial como conservantes de alimentos se ha vuelto cada vez más atractivo. En esta investigación, se aplicaron los bacteriófagos BC-S1 y BS-S2 al arroz cocido y la leche pasteurizada para controlar el crecimiento de B. cereus y B. subtilis, y los bacteriófagos ETEC-S3 y EHEC-S4 se aplicaron a la carne de pollo y lechuga fresca para controlar Crecimiento de ETEC y EHEC. Todos los fagos aislados podrían reducir significativamente su población de bacterias huésped en cada muestra a todas las temperaturas de almacenamiento. Se seleccionó el almacenamiento a temperatura ambiente y a baja temperatura porque generalmente era la temperatura común utilizada para almacenar alimentos y bebidas durante un período corto.

En general, la reducción bacteriana en las muestras de leche pasteurizada fue mayor que en el arroz cocido, y la reducción bacteriana en las muestras de carne de pollo fue mayor que en la lechuga. Estas capacidades de reducción pueden verse afectadas por las matrices de muestras de alimentos. La difusión limitada y el contacto de bacterias y fagos fueron responsables de la baja eficacia. Las partículas de fago pueden ser necesarias para reducir la contaminación bacteriana en las superficies húmedas de los alimentos y en los líquidos en comparación con una matriz alimentaria más seca debido a la mayor "movilidad" de los fagos en presencia de humedad. El contacto inicial del bacteriófago y la bacteria a menudo ocurre por difusión y movimiento browniano. Por lo tanto, las muestras líquidas, como la leche pasteurizada, permitieron una mayor difusión de los fagos que en la matriz sólida, como el arroz cocido, debido a los movimientos restringidos de la molécula del solvente28,31.

El tratamiento para la carne de pollo mostró una mayor reducción que la lechuga debido a sus jugos naturales. Cuando la carne de pollo no tiene espacio a su alrededor, el calor y la humedad no pueden escapar, dejando que el pollo se cocine al vapor en sus propios jugos. Es probable que los fagos en las muestras de lechuga no puedan alcanzar e invadir las bacterias, considerando que la lechuga tiene una matriz alimenticia seca. El movimiento pasivo de los fagos a través de las superficies de los alimentos está limitado debido a la falta de humedad32. Por otro lado, al mismo tiempo y temperatura, la reducción bacteriana en lechuga fue mayor en comparación con la carne de pollo en el tratamiento con el fago EHEC-S4. La situación es diferente en los alimentos sólidos con superficies uniformes como la lechuga, donde el área superficial total y su capacidad para absorber líquido de la suspensión de fagos son más fáciles que las áreas superficiales irregulares como la carne de pollo. Los alimentos con un área de superficie grande e irregular son difíciles de tratar con fagos porque la distribución de fagos está limitada físicamente para alcanzar todos los objetivos bacterianos. Además, las bacterias objetivo pueden estar incrustadas dentro de la matriz alimentaria bastante compleja, protegiéndolas de la difusión de partículas de fagos33.

Asimismo, la incubación a 28 °C mostró mayor reducción bacteriana que a 4 °C de incubación. La temperatura también puede afectar la actividad de los fagos, donde los fagos dependen del crecimiento de huéspedes bacterianos para su replicación. B. cereus, B. subtilis y E. coli crecen en el rango de temperatura mesófila, con un óptimo de alrededor de 37 °C. Una temperatura de crecimiento óptima del huésped bacteriano promueve una mejor replicación de las partículas de fago. Por el contrario, a una temperatura más baja, la tasa de replicación de los fagos disminuyó considerablemente o se detuvo debido a la menor tasa de crecimiento de sus huéspedes34.

Todos los bacteriófagos aislados en este estudio redujeron efectivamente el deterioro de los alimentos y las bacterias patógenas transmitidas por los alimentos. Sin embargo, se requirieron más estudios para determinar sus actividades contra otros patógenos y su estabilidad a diversas condiciones ambientales y caracterizar sus propiedades genómicas para garantizar su seguridad si se quiere utilizar como alternativa de conservación.

Los bacteriófagos se aislaron del suelo, luego se enriquecieron y purificaron. Se determinó la caracterización de los bacteriófagos aislados, incluido el título, el rango de huéspedes, la eficiencia de la siembra (EOP), la multiplicidad inhibitoria mínima de la infección (miMOI) y la morfología. También se evaluó la aplicación de los bacteriófagos aislados a muestras de alimentos.

En este estudio se utilizaron B. cereus ATCC 10876, B. subtilis ATCC 6633, ETEC US Namru-1 y EHEC US Namru-1 como cepas huésped para el aislamiento de bacteriófagos. Todas las cepas bacterianas se almacenaron en alícuotas de 1,0 ml de glicerol al 20 % (v/v) a -80 °C. Los cultivos bacterianos se inocularon en placas de agar Luria Bertani (LB) (Oxoid™) y se incubaron a 37 °C durante la noche. Las placas se mantuvieron a 4 °C y se utilizaron como cultivos de trabajo35.

El suelo cerca de la eliminación de desechos orgánicos se utilizó como muestras que se recolectaron en la aldea de Pakulonan Barat, subdistrito de Kelapa Dua, distrito de Tangerang de la provincia de Banten, Indonesia. Las muestras de suelo se transportaron al laboratorio y se procesaron para el aislamiento de bacteriófagos.

Cada cepa huésped bacteriana se cultivó en caldo Luria Bertani (LB) (Oxoid™) hasta la fase logarítmica media (OD600 = 0,132) mediante incubación a 37 °C, 120 rpm, durante la noche. Se agregaron seis gramos de muestra de suelo y 300 μL de cada cultivo bacteriano a 30 mL de caldo LB. Las muestras se complementaron con 100 μL de CaCl2 10 mM y 100 μL de MgSO4 0,5 mM para potenciar el crecimiento del bacteriófago12 y se incubaron a 37 °C, 150 rpm durante la noche. Luego, las muestras se centrifugaron a 7000 × g durante 15 min. El sobrenadante se filtró utilizando un filtro de jeringa desechable (HIMEDIA) con un tamaño de poro de 0,22 μm para eliminar las células bacterianas restantes. El filtrado se centrifugó nuevamente a 7000 × g durante 10 min y se analizó la presencia de bacteriófagos utilizando el ensayo de superposición de agar6,35. El ensayo de superposición de agar se realizó vertiendo agar superior (LB consta de 0,6 % de agar) en el agar inferior (LB consta de 2 % de agar), donde 150 μL de filtrado de bacteriófago, 150 μL de cultivo huésped bacteriano en fase logarítmica media, 50 μL de CaCl2 10 mM y 50 µl de MgSO4 0,5 mM se mezclaron en 4 ml de agar blando LB fundido y se vertieron en una placa de agar LB, seguido de incubación a 37 °C durante la noche. Se observó una clara formación de placa36.

Los bacteriófagos líticos aislados se purificaron pinchando suavemente la placa transparente con una punta estéril. Luego, la punta se colocó en 10 ml de caldo LB y se pipeteó hacia arriba y hacia abajo para liberar las partículas de bacteriófago. Los bacteriófagos se enriquecieron mediante la adición de 250 µl de cultivo huésped bacteriano de fase logarítmica media en el caldo LB y se incubaron a 37 °C durante la noche a 120 rpm. Después del enriquecimiento, la mezcla se centrifugó a 7000 × g durante 15 min y el sobrenadante se filtró utilizando un filtro de membrana de tamaño de poro de 0,22 µm (HIMEDIA) para obtener un stock de bacteriófagos. Los filtrados se mantuvieron en Solución Ringer (2.25 g NaCl, 0.105 g KCl, 0.12 g CaCl2, 0.05 g NaHCO3 en 500 mL de agua destilada) (Oxoid™) con una relación 1:1 (v/v) a 4 °C como solución de trabajo para su posterior análisis37,38,39.

Los títulos se determinaron utilizando el método de ensayo de superposición de agar37. Se realizaron una serie de diluciones de diez veces de solución de lisado de bacteriófago utilizando tampón SM (Tris-clorhidrato 50 mM (Tris-HCl) [pH 7,5], NaCl 0,1 M, sulfato de magnesio heptahidratado 8 mM (MgSO4·7H2O) y 0,01% (p/ v) gelatina). Cada dilución se sembró en placas de acuerdo con el ensayo de superposición de agar y se incubó a 37 °C durante la noche. El número de placas visibles se calculó entre 30 y 300 placas, que se expresó como unidad formadora de placa por mililitro (PFU/mL)35.

El rango de huéspedes de bacteriófagos aislados se determinó utilizando diferentes especies de bacterias huésped, a saber, contra B. cereus ATCC 10876, B. subtilis ATCC 6633, ETEC US Namru-1, EHEC US Namru-2, EPEC de US-Namru 2 y V. cholerae ATCC 14033. El bacteriófago aislado se analizó frente a diferentes huéspedes para probar su susceptibilidad con el ensayo de superposición de agar y se incubó a 37 °C durante la noche40.

La EOP se probó mediante un ensayo de superposición de agar y se realizó 3 veces de replicación y se calculó dividiendo el PFU promedio en las bacterias objetivo por el PFU promedio en las bacterias huésped21.

Los cultivos hospedantes bacterianos se cultivaron hasta la fase logarítmica media y se suspendieron para que coincidieran con el estándar de McFarland de 0,132. El cultivo huésped y el lisado de bacteriófagos se diluyeron para contener diferentes MOI de 0,00001 a 100. Cada uno de ellos se distribuyó en 100 μL en la placa de microtitulación de 96 pocillos y luego se incubó a 37 °C durante 10 h. Las concentraciones se determinaron cada 1 h utilizando un lector de microplacas (Tecan Infinite® M200 PRO)41.

La morfología de los bacteriófagos aislados se determinó mediante Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM) en el Instituto Eijkman de Biología Molecular, Yakarta, Indonesia. Aproximadamente 10 μL de bacteriófago se dejaron caer sobre una rejilla (malla 400) y se dejó durante 30 s. Las muestras de bacteriófagos se tiñeron negativamente con 5 μl de acetato de uranilo al 2 % (p/v) en rejillas recubiertas de carbono. Las cuadrículas se observaron utilizando JEM-1010 TEM (JEOL, Tokio, Japón) con un aumento de × 30,00042,43.

Como muestras de alimentos se utilizaron arroz cocido, leche pasteurizada, carne de pollo y lechuga fresca. La carne de pollo cruda se cortó en trozos (1 cm x 1 cm). El arroz cocido y la carne de pollo cruda se colocaron en tubos Falcon de 50 mL (Corning®) por aproximadamente 1 g por cada tubo, mientras que la leche pasteurizada (1 mL) se colocó en tubos Falcon de 15 mL (Corning®). Estas muestras se esterilizaron en autoclave durante 15 min a 121 °C para eliminar todas las bacterias naturales33. Mientras tanto, las lechugas frescas se enjuagaron con agua limpia y luego se frotaron con alcohol al 96% en sus superficies. Las lechugas se cortaron en trozos (1 cm × 1 cm) y se colocaron en tubos Falcon de 50 mL (Corning®). Luego, los tubos se expusieron a la luz ultravioleta del flujo de aire laminar (ESCO) durante aproximadamente 45 min44.

Después de la esterilización, cada muestra de arroz cocido y leche pasteurizada se inoculó con 100 μL de suspensiones de cepas hospedantes bacterianas de fase logarítmica media (B. cereus y B. subtilis) y 100 μL de bacteriófagos aislados (BC-S1 y BS-S2) que se diluyeron para contener MOI de 0,1. Mientras que cada muestra de carne de pollo y lechuga fresca se inoculó con 100 μL de suspensiones de cepas hospedantes bacterianas de fase logarítmica media (ETEC y EHEC) y 100 μL de bacteriófagos aislados (ETEC-S3 y EHEC-S4) que se diluyeron para contener MOI 0.001 para ETEC y MOI 1 para EHEC. A continuación, todas las muestras se incubaron a 4 °C y 28 °C durante la noche45.

Después de la incubación, se añadieron 10 ml de tampón SM a cada muestra y los tubos se agitaron durante unos 3 min. Luego, cada muestra se diluyó en serie y se esparció en una placa de agar LB, se incubó a 37 °C durante la noche. Para el control positivo, las muestras de alimentos se inocularon solo con la cepa huésped. Para el control negativo, las muestras de alimentos se inocularon únicamente con lisado de bacteriófago aislado. Las colonias se contaron entre 30 y 300 colonias que se expresaron como unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC/mL)46.

Los datos se recogieron después de 3 veces de replicación y el análisis estadístico se realizó utilizando ANOVA unidireccional seguido de la prueba B de Tukey (SPSS Inc. IBM Corporation). El nivel de diferencia se definió en P ≤ 0,05, y letras diferentes en cada columna indicaron diferencias significativas con respecto a otras muestras. Para el apareamiento control-tratamiento de cada muestra, se determinó su reducción significativa mediante la prueba T para muestras apareadas con el nivel de diferencias definido en P ≤ 0,0547.

Cuatro bacteriófagos líticos, BC-S1, BS-S2, ETEC-S3 y EHEC-S4 se recuperaron con éxito de muestras de suelo. Se consideraron fagos altamente específicos con un espectro estrecho de rango de huéspedes, donde se encontró que el fago ETEC-S3 era ineficaz contra B. cereus y el fago EHEC-S4 tenía poca eficacia contra EPEC. Esta estrecha propiedad es deseable porque normalmente tiene una gran especificidad para el anfitrión. Mediante el uso de TEM, el fago BC-S1 y BS-S2 podrían clasificarse como uno de los miembros de Caudovirales. Estos fagos mostraron una reducción significativa en muestras de alimentos en miMOI de 0,1 para el fago BC-S1 y BS-S2, miMOI 0,001 para el fago ETEC-S3 y miMOI 1 para el fago EHEC-S4 a 4 °C y 28 °C de temperatura de almacenamiento. . Estos resultados mostraron la eficacia potencial de los bacteriófagos para reducir el deterioro de los alimentos y las bacterias transmitidas por los alimentos. Por lo tanto, también es prometedor para ser estudiado más a fondo.

Este estudio solo evaluó algunas de las bacterias patógenas transmitidas por los alimentos y el deterioro de los alimentos; además, los alimentos que se analizaron son limitados, por lo tanto, es necesario explorar otros microbios y muestras de alimentos. Por otro lado, también debe caracterizarse más por sus propiedades genómicas como el factor de virulencia y los genes de resistencia a los antibióticos, así como la supervivencia de este bacteriófago en diversas condiciones de procesamiento de alimentos.

Los datos de este estudio están disponibles con el autor correspondiente a pedido.

Escherichia coli enterohemorrágica

Eficiencia de chapado

Escherichia coli enteropatógena

Escherichia coli enterotoxigénica

Multiplicidad inhibitoria mínima de la infección

Tampón de sodio y magnesio

Microscopio de transmisión por electrones

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Nos gustaría agradecer al Ministerio de Educación de Indonesia que financió esta investigación a través de la Subvención Nacional de Investigación Competitiva 2021.

Este estudio fue financiado por el Ministerio de Educación de Indonesia-2021. El financiador no tiene ninguna contribución en este estudio.

Departamento de Tecnología Alimentaria, Facultad de Biotecnología, Universidad Católica Atma Jaya de Indonesia, Jenderal Sudirman 51 Street, South Jakarta, DKI Jakarta, 12930, Indonesia

Hija de Christy Artawinata y Sesilia Lorraine

Departamento de Maestría en Biotecnología, Facultad de Biotecnología, Universidad Católica Atma Jaya de Indonesia, Jenderal Sudirman 51 Street, South Jakarta, DKI Jakarta, 12930, Indonesia

diana elizabeth waturangi

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Investigador personal DEW, proyecto de investigación de concepción y diseño, interpretación de datos y asesoramiento de la investigación. PCA y SL realizaron la investigación, recopilaron los datos, analizaron y procesaron los datos y prepararon el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Diana Elizabeth Waturangi.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Artawinata, PC, Lorraine, S. & Waturangi, DE Aislamiento y caracterización de bacteriófagos del suelo contra el deterioro de los alimentos y las bacterias patógenas transmitidas por los alimentos. Informe científico 13, 9282 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36591-6

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Recibido: 09 Diciembre 2022

Aceptado: 06 junio 2023

Publicado: 07 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36591-6

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