La supresión de la enzima málica humana 2 modifica el metabolismo energético e inhibe la respiración celular

Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 548 (2023) Citar este artículo

596 Accesos

2 Altmetric

Detalles de métricas

La enzima málica dependiente de NAD(P)+ mitocondrial humano (ME2) es bien conocida por su papel en el metabolismo celular, que puede estar implicado en el cáncer o la epilepsia. Presentamos potentes inhibidores de ME2 basados ​​en estructuras cyro-EM que se dirigen a la actividad de la enzima ME2. Dos estructuras de complejos inhibidores de ME2 demuestran que el ácido 5,5'-metilendisalicílico (MDSA) y el ácido embónico (EA) se unen alostéricamente al sitio de unión de fumarato de ME2. Los estudios de mutagénesis demuestran que se requieren Asn35 y la red Gln64-Tyr562 para la unión de ambos inhibidores. La sobreexpresión de ME2 aumenta la producción de piruvato y NADH mientras disminuye la relación NAD+/NADH de la célula; sin embargo, la caída de ME2 tiene el efecto contrario. MDSA y EA inhiben la síntesis de piruvato y, por lo tanto, aumentan la relación NAD+/NADH, lo que implica que estos dos inhibidores interfieren con los cambios metabólicos al inhibir la actividad celular de ME2. Silenciar ME2 o inhibir la actividad de ME2 con MDSA o EA disminuye la respiración celular y la síntesis de ATP. Nuestros hallazgos sugieren que ME2 es crucial para el piruvato mitocondrial y el metabolismo energético, así como para la respiración celular, y que los inhibidores de ME2 podrían ser útiles en el tratamiento del cáncer u otras enfermedades que involucran estos procesos.

La enzima málica ME es una nueva clase de descarboxilasas oxidativas que catalizan la conversión de L-malato en piruvato mientras reducen simultáneamente NAD(P)+ a NAD(P)H1,2,3,4. Las enzimas málicas en los mamíferos se clasifican en tres isoformas, ME1, ME2 y ME3, según su localización subcelular y la especificidad del cofactor, y cada una cumple una función fisiológica distinta. ME1 es un ME dependiente de NADP+ citosólico implicado en la generación de NADPH citoplasmático para la biosíntesis reductora y la reposición del intermedio del ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) mediante la transformación inversa de piruvato en L-malato5,6. ME3 es un ME dependiente de NADP+ mitocondrial de expresión insignificante que puede estar involucrado en el ciclo de NADPH en las mitocondrias5. ME2 es un ME dependiente de NAD+ o NADP+ que se encuentra en las mitocondrias y está involucrado en la generación de NADH y NADPH mitocondrial4,7,8,9. ME2 se distingue de las otras dos isoformas de mamíferos por su doble especificidad de cofactor y un sistema regulador alostérico complejo. Además, solo la isoforma ME2 coopera con el sustrato L-malato, y el fumarato puede activar alostéricamente la enzima mientras que el ATP inhibe su actividad enzimática10,11,12,13,14,15,16,17,18,19.

ME2 se identificó inicialmente en las mitocondrias del hepatoma8 y, desde entonces, se ha identificado en la leucemia, el melanoma, el glioma y el cáncer de mama9,20,21,22, donde está fuertemente asociado con la progresión y la supervivencia del cáncer. Como resultado, se ha identificado como un objetivo prometedor para la terapia del cáncer23. También está presente en los islotes pancreáticos de células de insulinoma humano, de rata y de ratón, y puede contribuir a la secreción de insulina estimulada por aminoácidos y proporcionar suficiente piruvato para aumentar el flujo del ciclo de Krebs cuando la glucosa es limitada24,25. ME2 también se requiere para la proliferación y diferenciación de osteoblastos26. La actividad de ME2 es extremadamente abundante en las mitocondrias sinápticas del cerebro, lo que indica que desempeña un papel en la ruta de reciclaje del piruvato y en el mantenimiento del glutatión reducido intramitocondrial en las terminales sinápticas27. El gen ME2 se ha relacionado con síndromes de epilepsia. Usando métodos de asociación de casos y controles y basados ​​en la familia, se encontró que estaba asociado con la epilepsia generalizada idiopática (IGE) en un estudio.

ME2 ha sido identificado con un gen asociado con síndromes de epilepsia. Se identificó con el gen asociado con la epilepsia generalizada idiopática (IGE) en un estudio utilizando métodos de asociación de casos y controles y basados ​​en la familia28. El haplotipo de polimorfismo de un solo nucleótido ME2 (SNP) se ha relacionado con un mayor riesgo de IGE y predispone a la epilepsia generalizada genética de inicio en la adolescencia29.

En las células tumorales, la glutaminólisis a través del ciclo del ácido tricarboxílico puede cooperar con la oxidación del malato a piruvato a través de ME24,9,30. El glutamato y la glutamina se utilizan como fuentes de energía en las células cancerosas, y ME2 puede desempeñar un papel fundamental en la glutaminólisis30,31. ME2 convierte el L-malato, que se deriva de la glutamina, en las mitocondrias en piruvato y NAD(P)H30,31,32,33. Al producir NADH y piruvato, la ME2 puede desempeñar un papel importante en la producción de energía en tejidos y células tumorales que proliferan rápidamente8,31,34; al producir NADPH, ME2 genera los equivalentes reductores para la reducción del glutatión35,36.

Se ha demostrado que ME2 está regulado negativamente por p53 y su expresión protege a las células cancerosas de la senescencia celular causada por p5337. Dos elementos de respuesta funcional de p53 están ubicados en el primer intrón del gen ME2, lo que implica que p53 puede actuar como un represor transcripcional para ME237. De hecho, existe una relación reguladora recíproca entre p53 y las enzimas málicas, que determina el destino irreversible de la célula a través de la vía metabólica involucrada en ME238. Hemos demostrado la importancia de ME2 en el melanoma cutáneo20. La deficiencia de ME2 en las células de melanoma da como resultado una disminución de los niveles de ATP y un aumento de los niveles de ROS, lo que desencadena la actividad de la proteína quinasa activada por AMP (AMPK), lo que promueve la fosforilación y activación de p53 y, en última instancia, la muerte celular20. Se ha investigado el efecto de los análogos estructurales del sustrato de malato y el fumarato activador alostérico en ME2 humano39,40. Además, nuestro laboratorio descubrió un inhibidor de molécula pequeña, el ácido embónico (EA), que es específico de ME2, y el EA inhibe el crecimiento de células de cáncer de pulmón e induce la senescencia celular41.

La enzima málica es un homotetrámero, o dímero de dímeros, en el que la interfaz del dímero está acoplada más estrechamente que la interfaz del tetrámero42. Las estructuras cristalinas de la ME2 humana en complejo con sus ligandos revelan que cada monómero de la enzima contiene dos sitios de unión a ligandos adicionales11. Un sitio está ubicado en la interfaz del dímero y es responsable de unir el fumarato11 del activador alostérico. El otro sitio, ubicado en la interfase del tetrámero, es capaz de unirse a otro nucleótido, como NAD+ o ATP; este segundo sitio de unión a nucleótidos se denomina "sitio exo". Los ligandos de nucleótidos en el sitio exo tienen funciones biológicas discretas que incluyen la regulación de la estructura cuaternaria y la catálisis de ME219. El ME2 humano puede existir tanto en forma abierta como cerrada. La estructura de la ME2 humana en su complejo binario con el cofactor NAD+ es representativa de la forma abierta I, mientras que la estructura de los complejos pentarios como ME2-nucleótido (NAD+, NADH o ATP)-catión divalente (Mg2+ o Mn2+)-sustrato (piruvato o L-malato)-fumarato es representativa de la forma cerrada II de la enzima10,11,43. El gen ME2 humano contiene numerosas variantes de un solo nucleótido (SNV) en la región codificante, que pueden tener un efecto sobre la función de la enzima. Anteriormente establecimos que las SNV en el sitio de unión del fumarato alostérico y el exositio dan como resultado la inactivación o hiperactivación de ME2, y las estructuras ME2-SNV resueltas proporcionan una base molecular para explicar las propiedades cinéticas anormales de las enzimas SNV44.

En este artículo, describimos las estructuras complejas de ME2 y sus inhibidores alostéricos, demostrando el efecto perjudicial de los inhibidores en la transición de estructura; también discutimos el papel de ME2 en el metabolismo energético. Investigamos la eficacia de los inhibidores alostéricos de ME2, EA y MDSA, en la inhibición del metabolismo energético y del piruvato mediado por ME2 en tres células no cancerosas, lo que demuestra el papel de ME2 en el metabolismo energético al aumentar la producción de piruvato y NADH, lo que aumenta la producción de ATP, así como en la anti-oxidación cuando las mitocondrias están sujetas a un alto nivel de estrés oxidativo. Este artículo proporciona una ilustración perfecta de la regulación alostérica de las enzimas, demostrando los efectos de los inhibidores alostéricos sobre su estructura y función, así como sobre el metabolismo energético celular. Además. utilizando enfoques bioquímicos, biofísicos y de metabolismo celular, explica el papel de ME2 en las mitocondrias, así como el papel de PFK en el citoplasma; ambos juegan un papel de detección de energía en sus respectivos orgánulos.

Sobre la base de la mutagénesis dirigida al sitio de las interfaces de dímero o tetrámero, el sitio de unión al fumarato y el sitio exo, informamos previamente que el 4,4'-metilen-bis(3-hidroxi-2-ácido naftoico), también conocido como ácido embónico (EA), puede actuar como un inhibidor alostérico de ME241. Además, se investigaron los efectos inhibitorios de una variedad de derivados del ácido disalicílico y del ácido naftoico sobre la actividad enzimática de ME2 (Fig. S1). Las estructuras químicas de estos derivados se enumeran en la Tabla S1, junto con sus valores IC50. Entre estos compuestos, un ácido disalicílico, el ácido 5,5'-metilendisalicílico (MDSA) tuvo un efecto inhibidor notable sobre ME2 con un IC50 de 0,51 µM (Fig. S1a), mientras que el ácido salicílico tuvo un efecto inhibidor insignificante sobre ME2 (IC50 = 800,7 µM, Fig. S1b). El ácido 3-benzoilbenzoico, que tiene un esqueleto de carbono similar al MDSA, tuvo un efecto inhibitorio insignificante sobre la actividad de ME2, con un valor IC50 de 652 µM, como se muestra en la Fig. S1b.

EA, un ácido bis 3-hidroxi-2-naftoico, tuvo un efecto inhibidor notable sobre ME2 con un IC50 de 1,1 µM. (Figura S1a). El efecto inhibidor del ácido 3-hidroxi-2-naftoico con un grupo hidroxilo en la posición 5', el ácido 3,5-dihidroxi-2-naftoico (CI50 de 12,4 µM; Fig. S1b) tiene un efecto inhibidor mayor que el del ácido 3,5-dihidroxi-2-naftoico. -ácido dihidroxi-2-naftoico con un grupo hidroxilo o bromo en la posición 7', ácido 3,7-dihidroxi-2-naftoico y ácido 7-bromo-3-hidroxi-2-naftoico (valores IC50 de 37,6 µM y 307,8 µM , respectivamente, Fig. S1b). Los derivados del ácido naftoico con grupos hidroxilo adyacentes, como el ácido 1-hidroxi-2-naftoico y el ácido 3-hidroxi-2-naftoico, exhiben un efecto inhibidor sobre la actividad considerablemente menor que el EA (valores IC50 de 74,7 µM y 105,4 µM, respectivamente; Fig. .S1b). El 2,6-dicarboxinaftaleno, un naftaleno que contiene ácido dicarboxílico, tuvo un efecto inhibitorio insignificante sobre la actividad de ME2, con un valor IC50 de 352,9 µM (Fig. S1b).

En el sitio activo de los ME, los residuos necesarios para la unión del sustrato y el metal se conservan sustancialmente en ME1 y ME23,10,42,43. ME2, pero no ME1, es una enzima alostérica, y el fumarato o los nucleótidos se unen a distintos sitios alostéricos para modular la actividad de ME23,11,12,16,17,19. De hecho, a diferencia de ME2, ME1 carece de un sitio alostérico en la interfaz del dímero, por lo que no puede ser activado por fumarato3,15. Los alineamientos de secuencias y los estudios cinéticos demuestran esta posibilidad12,16,17,45. La gran mayoría de los residuos del sitio alostérico en ME2 no se conservan en ME1. En consecuencia, ME1 no puede ser activado por fumarato, y es lógico pensar que ME1 puede no ser sensible a los inhibidores alostéricos.

ME2 es muy sensible a la inhibición de MDSA y EA, mientras que ME1 es notablemente menos sensible, lo que indica que ambos inhibidores se unen a sitios alostéricos. En este artículo, demostramos las estructuras crio-EM de ME2-MDSA y ME2-EA que revelan que el sitio de unión para los inhibidores específicos de ME2 MDSA y EA se encuentra en el sitio de unión de fumarato alostérico de la interfaz del dímero (Fig. 1). La estructura revela que Asp37 en ME1 puede obstaculizar estéricamente la unión de MDSA y EA, mientras que la glicina es el residuo correspondiente en ME2.

a Estructuras crio-EM del complejo binario ME2-NAD+ con una resolución de ∼ 2,7 Å. El exositio NAD+ está resaltado en azul. El mapa está contorneado a 6,7 ​​σ por encima de la media. b Estructura crio-EM del complejo ternario ME2-NAD+-EA con una resolución de ∼ 2,7 Å. El inhibidor EA está resaltado en color naranja. El sitio activo NAD+ está coloreado en rojo y el exositio NAD+ está coloreado en azul. El mapa tiene un contorno de 8,3 σ. c Estructura crio-EM del complejo ternario ME2-NAD+-MDSA con una resolución de ∼ 2,8 Å. El inhibidor MDSA se representa en color verde. El sitio activo NAD+ está coloreado en rojo y el exositio NAD+ está coloreado en azul. El mapa está contorneado en 8 σ. d Representaciones de dibujos animados del complejo binario ME2 con exositio NAD+ (esferas azules). Se muestran los sitios alostéricos (indicados por círculos discontinuos rojos), los sitios activos (indicados por círculos discontinuos morados) y los sitios exo (indicados por círculos discontinuos rosados). Las líneas discontinuas verticales y horizontales indican las interfaces de dímero y tetrámero, respectivamente. El complejo ternario ME2 con el sitio alostérico EA (esferas naranjas), el sitio activo NAD+ (esferas rojas) y el exositio NAD+ (esferas azules). f Complejo ternario ME2 con el sitio alostérico MDSA (esferas verdes) y el sitio activo NAD+ (esferas rojas) y el exositio NAD+ (esferas azules).

La estructura crio-EM de ME2 humano en complejos ternarios con NAD e inhibidores (EA o MDSA) se determinó a resoluciones de 2,72 Å y 2,82 Å, respectivamente (Fig. S2 y Tabla S2). Además, determinamos la estructura crio-EM de ME2 humano en ausencia del inhibidor a una resolución de 2.72 Å (Fig. S2 y Tabla S2). Los análisis crio-EM de una sola partícula de ME2, EA-ME2 y MDSA-ME2 libres de inhibidores se mostraron como una imagen crio-EM representativa, promedios de clase 2D sin referencia, mapas de resolución para las reconstrucciones finales, gráficos FSC estándar dorado para las reconstrucciones 3D y la distribución del ángulo de Euler de las imágenes de partículas (Fig. S2a-e, respectivamente). Los flujos de trabajo de procesamiento de datos para la estructura ME2 libre de inhibidores, ME2-EA y ME2-MDSA se representan en las Figs. S3–S5.

La estructura crio-EM general de ME2 libre de inhibidor tetramérico (Figs. 1a y 1d) es comparable a la del complejo binario con NAD+42. Como se muestra en el promedio de clase bidimensional de las imágenes del microscopio electrónico (Fig. S2b), los cuatro monómeros están ubicados en las cuatro esquinas de la estructura. En la estructura crio-EM de ME2 humano sin el inhibidor, la muestra se purificó en ausencia de los cofactores NAD+, y solo se observa una molécula de NAD+ en el sitio exo de la subunidad ME2 (Figs. 1a y 1d). El sitio activo de la estructura libre de inhibidores se expone al solvente, de manera similar a la forma abierta de ME242.

Ambos complejos inhibidores de ME2 (ME2-EA y ME2-MDSA) se generaron en presencia de los cofactores NAD+ y Mg2+, el sustrato natural piruvato (PYR) y el inhibidor (EA o MDSA), pero las estructuras demuestran que solo el El inhibidor (EA o MDSA) se une al sitio regulador alostérico en la interfaz del dímero (Figs. 1b, c, respectivamente), mientras que las moléculas de NAD+ aparecen en cada sitio activo y sitio exo en la interfaz del tetrámero (Figs. 1e, f). La parte del mononucleótido de nicotinamida (NMN) de NAD+ tiene densidades de electrones considerablemente más bajas en estas tres estructuras crio-EM del ME2 humano (Fig. 1), lo que implica que puede estar muy desordenado. El componente NMN pobremente resuelto de NAD+ también se ve en la estructura cristalina de ME211.

Estudios estructurales previos han descubierto las conformaciones abiertas y cerradas de ME2, que corresponden a los estados inactivo y activo de la enzima, respectivamente. El sitio activo está completamente expuesto al solvente en la forma abierta inactiva. Después de la unión de cationes divalentes (Mn2+ o Mg2+) y sustratos (malato o piruvato), el cierre del sitio activo está mediado predominantemente por el movimiento del cuerpo rígido del dominio del sitio activo hacia el sitio alostérico. Como consecuencia, los cationes divalentes y los sustratos están protegidos del solvente en la forma cerrada activa3,44.

En las estructuras que contienen inhibidores unidos (ME2-EA y ME2-MDSA), tanto EA como MDSA están unidos al sitio alostérico en la interfaz del dímero. A diferencia del fumarato, el volumen de ambos inhibidores requiere espacio adicional, lo que empuja al dominio B hacia el sitio activo. Este movimiento altera las ubicaciones espaciales de Glu255, Asp256 y Asp279. Arg165 reemplaza específicamente a Asp256 en la posición de la cadena lateral. Se ha demostrado que los aminoácidos altamente conservados Glu255, Asp256 y Asp279 son necesarios para la catálisis y quelación de iones divalentes en el sitio activo de MEs3,10,11,43. Por lo tanto, los arreglos espaciales inducidos por EA y MDSA conducen a la pérdida de iones divalentes en el sitio activo e inhiben la catálisis.

El fumarato puede desencadenar la actividad catalítica de la ME2 humana, y el activador alostérico se ha encontrado en la interfaz del dímero (Fig. 2d), aproximadamente a 30 Å de distancia de cada sitio activo (Fig. 1). El activador interactúa con las cadenas laterales de Arg67 y Arg91 en la región alostérica (Fig. 2d), y los estudios de mutagénesis confirman la importancia de los residuos de Arg67 y Arg91 en la unión del fumarato11,43.

Las estructuras ilustran las interacciones del ligando del sitio alostérico (paneles superiores) y las superficies de Coulombic que rodean el sitio alostérico (paneles inferiores). Las mallas grises representan las densidades de los ligandos y las barras representan los residuos que interactúan. Las interacciones de enlaces de hidrógeno se indican con líneas cian, las interacciones catión-π con líneas verdes y los pares de iones con líneas magenta. a, e El inhibidor EA se representa en barras naranjas en el complejo ME2-EA. El mapa está contorneado a 6,5 ​​σ por encima de la media. b, f MDSA se representa en barras verdes en el complejo ME2-MDSA. El mapa tiene un contorno de 7,5 σ. c, g Sitio alostérico de la ME2 sin inhibidor. d, h El fumarato activador se representa en barras de color cian oscuro en la forma cerrada ME2 (PDB ID: 1PJ3). El mapa tiene un contorno de 1,8 σ. Las superficies de Coulombic se calcularon utilizando la configuración predeterminada en UCSF Chimera55.

La estructura crio-EM del complejo inhibidor de ME2 (ME2-EA y ME2-MDSA) revela el inhibidor EA o MDSA en la región reguladora alostérica de la interfaz del dímero (Figs. 1b, c, respectivamente). EA interactúa con ME2 a través de pares de iones, interacciones catión-pi, enlaces de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas con los aminoácidos circundantes (Fig. 2a). Los residuos, Arg67 y Arg91 tienen interacciones catión-π con EA, mientras que Arg91 además forma un par de iones con EA. Asn35, Asn92 y Gln64 interactúan con EA a través de enlaces de hidrógeno, y existen redes de hidrógeno entre las cadenas laterales Gln64, Asn92 y Tyr562 (Fig. 2a).

MDSA forma pares de iones con residuos de subunidades adyacentes Arg67 y Arg128, mientras que Arg91 interactúa con MDSA a través de una interacción catión-π. Gln64 forma enlaces de hidrógeno con MDSA, y también existen redes de hidrógeno entre las cadenas laterales Gln64, Asn92 y Tyr562 (Fig. 2b). En comparación con la estructura ME2 sin el inhibidor (Fig. 2c), Arg91 del complejo ME2-EA se desplaza ligeramente hacia EA, formando una interacción catión-pi (Fig. 2a). En la estructura del complejo ME2-MDSA, no solo la cadena lateral de Arg91 cambia de dirección hacia MDSA, sino que la cadena lateral de Arg128 de otra subunidad también se mueve e interactúa con ella (Fig. 2b). A diferencia del fumarato, que interactúa principalmente con las cadenas laterales de Arg67 y Arg91 a través de interacciones de pares de iones (Fig. 2d), los inhibidores EA y MDSA interactúan principalmente con las cadenas laterales de Arg67 y Arg91 a través de interacciones de pares de iones y catión-pi ( Figuras 2a, b). El bolsillo del sitio alostérico es extensible, lo que le permite acomodar moléculas más grandes que el fumarato, como EA y MDSA (Figs. 2e-h).

Los cuatro sitios activos están ubicados en las esquinas de la estructura del tetrámero ME2 humano, separados aproximadamente por 60 Å (Fig. 1). La estructura crio-EM de la forma abierta de ME2 sin inhibidor es un complejo binario con solo el exositio NAD+; los sitios activos no tienen ligandos y están completamente expuestos al solvente. (Figura 3c). La forma cerrada de ME2 es un complejo pentario con el producto natural piruvato, cofactor NAD+, Mn2+ y fumarato3,43. A pesar de la adición de piruvato durante la preparación crio-EM de ambas muestras (Figs. 1b, c, respectivamente), el sustrato piruvato no se detectó en las estructuras del complejo ternario ME2-EA y ME2-MDSA, y el sitio activo contenía solo el NAD+ molécula (Figs. 3a, b).

Las estructuras ilustran las interacciones de los ligandos del sitio activo NAD+ (a, b, c y d) y las superficies de Coulombic que rodean el sitio activo (e, f, g y h). Las mallas grises representan las densidades de los ligandos y las barras representan los residuos que interactúan. Las interacciones de enlaces de hidrógeno se indican con líneas cian, las interacciones catión-π con líneas verdes y los pares de iones con líneas magenta. En los paneles superiores, solo se muestra la porción ADP de la molécula NAD+. a, e El sitio activo NAD+ y los residuos que interactúan se representan como barras de color azul claro en el complejo ME2-EA. El mapa está contorneado a 5 σ por encima de la media. b, f El sitio activo NAD+ y los residuos que interactúan se representan como barras rosadas en el complejo ME2-MDSA. El mapa tiene un contorno de 7,5 σ por encima de la media. c, g No se observó NAD+ en el sitio activo, y los residuos que rodean el bolsillo en el ME2 sin inhibidor se representan como barras grises. d, h El sitio activo NAD+ y los residuos que interactúan se representan como barras amarillas en la forma cerrada de ME2 (PDB ID: 1PJ3). El mapa está contorneado a 1,5 σ por encima de la media. Las superficies de Coulombic se calcularon utilizando la configuración predeterminada en UCSF Chimera55.

El sustrato piruvato, el cofactor NAD+ y los cationes divalentes Mg2+ están todos unidos a los residuos circundantes en la forma cerrada del sitio activo de ME2 (Fig. 3d), y están protegidos en la hendidura profunda (Fig. 3h). Comparando los sitios activos en las estructuras de ME2-EA y ME2-MDSA y en las formas abierta y cerrada de ME2, los bolsillos del sitio activo de ME2-EA (Fig. 3a) y ME2-MDSA (Fig. 3b) están en una estado abierto similar a la forma abierta de ME2 (Fig. 3c), lo que indica que la unión de EA y MDSA bloquea la conformación de la enzima en la forma abierta catalíticamente inactiva. El bolsillo NAD+ del sitio activo está ligeramente abierto, lo que puede hacer que el resto NMN sea más flexible (Figs. 3e-h).

El sitio exo de ME2 humano en cada subunidad está ubicado en la interfaz del tetrámero, aproximadamente a 35 Å de distancia del sitio activo (Fig. 1). Nuestras estructuras crio-EM de los complejos ternarios ME2-EA y ME2-MDSA, así como la forma abierta de ME2, revelan que solo la porción ADP de la molécula NAD+ está ordenada en los sitios exo de ME2 (Fig. S6), consistente con observaciones cristalográficas previas (PDB ID: 1PJ3, Fig. S6d). La base de adenina de NAD+ forma enlaces de hidrógeno con la amida de Arg194 y el carbonilo de Arg556, mientras que las cadenas laterales de Arg197 forman enlaces de hidrógeno con la ribosa de NAD+. Los enlaces de hidrógeno se forman entre los grupos fosfato de NAD+ y las cadenas laterales de Arg542 y Arg556 (Figs. S6a, S6b y S6c). Una comparación de las interacciones de ligandos del exositio NAD+ en las estructuras de ME2-EA y ME2-MDSA y las formas abierta y cerrada de ME2 revela que las porciones de ADP están orientadas de manera similar en ellas (Fig. S6).

Con base en las estructuras de ME2-EA y ME2-MDSA, diseñamos 16 mutantes de ME2 y evaluamos su susceptibilidad a la inhibición de MDSA o EA para determinar qué residuos de aminoácidos se requieren para la unión e inhibición de MDSA o EA (Fig. S7). Arg67 y Arg91 son ligandos directos de fumarato; tanto los mutantes R67A como R91A fueron menos sensibles a MDSA o EA, con valores de IC50 aumentados (Tabla 1). Debido a que Arg67 es el ligando que interactúa directamente con MDSA, el mutante R67A demostró una actividad notablemente menos inhibida por MDSA, con un valor IC50 de 185 µM, que fue más de 300 veces mayor que el de WT (Tabla 1). Arg67 y Glu59 forman un puente salino, y Glu59 tiene un par de iones con Lys57. Sin embargo, los mutantes K57 y E59 permanecieron susceptibles a la inhibición de MDSA o EA, con valores de IC50 comparables a los del WT (Tabla 1).

Gln64 sirve como ligando principal para la unión de MDSA o EA, mientras que Tyr562 forma un enlace de hidrógeno con Gln64. Q64N tenía valores de IC50 de 62,4 µM y 38,2 µM, y Y562A tenía valores de IC50 de 40,8 µM y 46,1 µM, para MDSA y EA, respectivamente, valores que obviamente eran mayores que los de WT (Tabla 1), lo que indica que la Gln64-Tyr562 se requiere un par para la unión de MDSA o EA en el sitio alostérico.

Debido a la unión directa de Asn35 a EA, el valor de IC50 de N35D fue 10 veces mayor que el de WT, mientras que los valores de IC50 de N35A y N35Q fueron 70 y 160 veces mayores que los de WT (Tabla 1), lo que indica que la especificidad estructural de la cadena lateral de Asn35 es crucial para la unión de EA. En consecuencia, a pesar de que Asn35 no interactúa directamente con MDSA, los mutantes N35 fueron menos susceptibles a la inhibición de MDSA debido al efecto de cadena lateral de Asn35. Asn92 tiene una interacción directa con EA, mientras que Arg128 tiene una interacción directa con MDSA. Ambos residuos no son necesarios para la unión de MDSA o EA, como lo indica el hecho de que los valores de IC50 de los mutantes N92A, N92Q y R128A no aumentaron notablemente, lo que indica que estos mutantes permanecieron susceptibles a la inhibición de MDSA o EA (Tabla 1).

Si bien estos mutantes de ME2 que se unen a inhibidores exhiben una amplia gama de propiedades cinéticas (Tabla S3) y la mayoría son insensibles al fumarato activador alostérico (Fig. S8), como se informó anteriormente en la literatura44, sus estructuras secundarias generales son bastante similares a los del WT (Fig. S9), lo que indica que la mutación de estos residuos no resultó en cambios conformacionales sustanciales, y la susceptibilidad de los mutantes ME2 a la inhibición de MDSA o EA fue determinada por la geometría local del sitio alostérico de ME2.

MDSA y EA se introdujeron para determinar su efecto inhibitorio sobre ME2 celular en tres líneas celulares no cancerosas: HEK293T (células 293 de riñón embrionario humano), HFL-1 (células de fibroblastos de pulmón humano) y MRC-5 (células de fibroblastos de pulmón embrionario humano). ), y dos líneas celulares cancerosas: H1299 (carcinoma de pulmón de células no pequeñas humano) y MCF-7 (adenocarcinoma de mama humano). Las cinco líneas celulares exhibieron expresión de ME2 (Figs. S10a-10d). También establecimos células HEK293T estables con plásmidos de sobreexpresión de ME2 (vector pcDNA3 y pcDNA3-ME2; Fig. S10e) y con shRNA para la eliminación de ME2 (shCon y shME2; Fig. S10a), como controles positivo y negativo, respectivamente.

ME2 cataliza la oxidación del malato seguida de la reducción de NAD+ o NADP+ para formar piruvato y NADH o NADPH. Como resultado, los niveles de piruvato, NADH y NADPH, así como la relación NAD+/NADH, se determinaron primero en las células HEK293T que sobreexpresan ME2 y que eliminan ME2 (Fig. 4). Las células que sobreexpresan ME2 habían aumentado los niveles de piruvato y NADH, y una relación NAD+/NADH disminuida (Figs. 4a, b, c, respectivamente), mientras que las células silenciadas con ME2 tenían niveles reducidos de piruvato y NADH, y una relación NAD+/NADH aumentada ( Figs. 4a, b, c, respectivamente). Cuando se trataron con MDSA o EA, las células HEK293T, HFL-1 y MRC-5 también fueron susceptibles a la inhibición de ME2. El tratamiento con EA o MDSA inhibió eficazmente la actividad de ME2 en las células HEK293T, HFL-1 y MRC-5, lo que resultó en una disminución de los niveles de piruvato (Figs. 4a, d y S11a, respectivamente) y NADH (Figs. 4b, e y S11b, respectivamente) y un aumento en la relación NAD+/NADH (Figs. 4c, f y S11c, respectivamente), similares a los de ME2-silencio (Figs. 4a–c).

El cambio en los niveles de piruvato celular y NADH, la relación NAD+/NADH, ATP, NADPH y especies reactivas de oxígeno (ROS) en sobreexpresión de ME2 (ME2-Over), ME2-knockdown (ME2-KD), tratados con EA, y células tratadas con MDSA. a El cambio de veces en los niveles de piruvato en las células HEK293T. N = 3-4. Prueba t de Student no apareada. *p < 0,05, ***p < 0,001. b El pliegue cambia los niveles de NADH en las células HEK293T. N = 3. Prueba t de Student no apareada. *p < 0,05, ***p < 0,001. c La proporción de NAD+/NADH en células HEK293T. N = 3. Prueba t de Student no apareada. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. d El cambio de veces en los niveles de piruvato en las células HFL-1. N = 3. Prueba t de Student no apareada. ** p < 0,01, *** p < 0,001. e El cambio de veces en los niveles de NADH en las células HFL-1. N = 3. Prueba t de Student no apareada. ** p < 0,01, *** p < 0,001. f El cambio de pliegue en la proporción de NAD+/NADH en células HFL-1. N = 3. Prueba t de Student no apareada. *p < 0,05, **p < 0,01. g El cambio de veces en los niveles de ATP en las células HEK293T. N = 3-4. Prueba t de Student no apareada. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. h El cambio de veces en los niveles de NADPH en las células HEK293T. N = 3-4. Prueba t de Student no apareada. ** p < 0,01. ns, sin significación estadística. i El cambio de veces en los niveles de ROS en las células HEK293T. N = 3-4. Prueba t de Student no apareada. ** p < 0,01. ns, sin significación estadística. j El cambio de veces en los niveles de ATP en las células HFL-1. N = 3-4. Prueba t de Student no apareada. *p < 0,05, **p < 0,01. k El cambio de veces en los niveles de NADPH en las células HEK293T. N = 3. Prueba t de Student no apareada. ** p < 0,01. l El cambio de veces en los niveles de ROS en las células HEK293T. N = 3. Prueba t de Student no apareada. *p < 0,05, **p < 0,01. Los gráficos de barras ilustran el cambio de veces en los niveles de estos metabolitos después de 48 h. Las barras de error son la media ± SD.

La relación NAD+/NADH y los niveles de ATP en la célula son indicadores críticos del metabolismo energético. Las células que sobreexpresan ME2 tenían una proporción más baja de NAD+/NADH (Fig. 4c) y niveles más altos de ATP (Fig. 4g), mientras que las células silenciadas con ME2 experimentaron lo contrario (Figs. 4c, g), lo que indica que ME2 se correlaciona positivamente con la energía. metabolismo. El tratamiento con EA o MDSA aumentó la relación NAD+/NADH y disminuyó los niveles de ATP en las células HEK293T (Figs. 4c, g, respectivamente). Se observaron resultados similares en células HFL-1 y MRC-5 tratadas con EA o MDSA. El tratamiento con EA o MDSA en células HEK293T, HFL-1 y MRC-5 resultó en una disminución de los niveles de ATP (Fig. 4g, j y S11d, respectivamente) y NADH (Figs. 4b, e y S11b, respectivamente), lo que indica que MDSA y EA pudieron regular negativamente el metabolismo energético de la célula al inhibir la actividad de ME2.

Los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) en las células HEK293T tratadas con MDSA o EA permanecieron constantes (Fig. 4i), lo que corresponde a niveles de NADPH sin cambios (Fig. 4h). En las células MRC-5, el tratamiento con EA resultó en una disminución en la producción de NADPH (Fig. S11e), lo que resultó en un aumento en el nivel de ROS (Fig. S11f). Después de ser tratadas con MDSA o EA, las células HFL-1 también produjeron menos NADPH (Fig. 4k), mientras que la producción de ROS aumentó al mismo tiempo (Fig. 4l). Es posible que el estrés oxidativo causado por el aumento de ROS y la disminución de NADPH en las células HFL-1 sea la causa del mayor efecto del tratamiento con MDSA o EA sobre la viabilidad celular observado con la célula HFL-1 (Fig. S12c). La célula HFL-1 fue la más susceptible de las tres células no cancerosas a la inhibición de ME2 mediada por MDSA o EA (Fig. S12a–S12c); esto se debió al hecho de que MDSA y EA tuvieron un efecto supresor pronunciado sobre él, reduciendo no solo los niveles de piruvato y NADH (Figs. 4d y 4e, respectivamente), sino también los niveles de NADPH (Fig. 4k).

Continuamos examinando la eficacia de EA o MDSA en las alteraciones metabólicas asociadas a ME2 en las líneas celulares cancerosas H1299 y MCF-7 (Fig. 5 y S13, respectivamente). Se encontró ME2 en ambas líneas celulares (Fig. S10d). Fue intrigante que las células H1299 fueran sensibles a EA o MDSA, como lo demuestra una reducción en la producción de piruvato, ATP y NADPH y un aumento en la producción de ROS (Figs. 5a-d, respectivamente). Un aumento de ROS y una disminución de NADPH en las células H1299 dieron como resultado una mortalidad celular obvia (Fig. S12d). Por el contrario, ni EA ni MDSA tienen efectos sustanciales sobre el metabolismo dirigido por ME2 en las células MCF-7 (Fig. S13a–S13d) o la viabilidad celular en las células MCF-7 (Fig. S12e), lo que indica que el efecto del fármaco en ME2 -Células expresadas es variable.

El cambio proporcional de piruvato celular, ATP, NADPH y ROS en células H1299 en presencia de EA o MDSA (0, 75 y 150 µM). a El cambio de veces en los niveles de piruvato. N = 3. Prueba t de Student no apareada. * p < 0,05. b El cambio de veces en los niveles de ATP. N = 3. Prueba t de Student no apareada. ** p < 0,01. c El cambio de veces en los niveles de NADPH. N = 3. Prueba t de Student no apareada. ** p < 0,01. d El cambio de veces en los niveles de ROS. N = 3. Prueba t de Student no apareada. * p < 0,05. e La tasa de consumo de oxígeno en células H1299 tratadas con EA. N = 3. f La tasa de respiración basal. N = 7, 8 y 11, de izquierda a derecha. ANOVA unidireccional con prueba de Dunnett. *p < 0,05, ***p < 0,001. g La frecuencia respiratoria máxima. N = 7, 8 y 11, de izquierda a derecha. ANOVA unidireccional con prueba de Dunnett. ** p < 0,01, *** p < 0,001. h Producción de ATP. N = 7, 6 y 11, de izquierda a derecha. ANOVA unidireccional con prueba de Dunnett. *p < 0,05, ***p < 0,001. i La capacidad de respiración de repuesto. N = 7, 8 y 11, de izquierda a derecha. ANOVA unidireccional con prueba de Dunnett. *p < 0,05, ***p < 0,001. j La tasa de consumo de oxígeno en células H1299 tratadas con MDSA (N = 3–5). k La tasa de respiración basal. N = 7, 16 y 13, de izquierda a derecha. ANOVA unidireccional con prueba de Dunnett. *** p < 0,001. l La frecuencia respiratoria máxima. N = 7, 16 y 13, de izquierda a derecha. ANOVA unidireccional con prueba de Dunnett. *p < 0,05, ***p < 0,001. producción de ATP. N = 7, 16 y 13, de izquierda a derecha. ANOVA unidireccional con prueba de Dunnett. *** p < 0,001. n La capacidad de respiración sobrante. N = 8, 16 y 13, de izquierda a derecha. ANOVA unidireccional con prueba de Dunnett. ns, sin significación estadística. Las barras de error son la media ± SD. Oligo: Oligomicina; FCCP: cianuro de carbonilo-4 (trifluorometoxi) fenilhidrazona; Pudrición/Hormiga: Rotenona/Antimicina A.

Se utilizó espectrometría de masas para determinar los cambios en los niveles de piruvato, malato, fosfoenolpiruvato (PEP) y glucosa después del tratamiento con MDSA o EA (Fig. S14). La inhibición de ME2 por MDSA o EA, como se anticipó, resultó en una disminución de piruvato (Fig. 4 y S14). Por otro lado, el nivel de malato celular se mantuvo relativamente constante, lo que indica que la inhibición de la actividad de ME2 no da como resultado la acumulación de malato (Fig. S14). Además, la inhibición de la actividad de ME2 no tuvo efecto sobre los niveles celulares de PEP y glucosa (Fig. S14). Como resultado de estos hallazgos, se puede concluir que la inhibición de ME2 disminuyó la generación de piruvato sin afectar la glucólisis.

Realizamos experimentos de tasa de consumo de oxígeno (OCR) para determinar la capacidad de respiración y la cantidad de ATP producida por la fosforilación oxidativa (Fig. 6). El analizador Agilent Seahorse XF se utilizó para medir la respiración celular de las células silenciadas con ME2, así como las células tratadas con MDSA o EA. El OCR disminuyó considerablemente en las células HEK293T silenciadas con ME2 (Fig. 6a), al igual que la respiración basal y máxima (Figs. 6b, c), la cantidad de ATP producido por la fosforilación oxidativa (Fig. 6d) y la respiración de reserva capacidad (Fig. 6e), lo que demuestra que el silencio ME2 reduce sustancialmente la respiración celular y la producción de ATP.

a La tasa de consumo de oxígeno en las células HEK293T de control ME2 (shCon) y eliminación de ME2 (shME2). N = 3–6. b La tasa de respiración basal. N = 16 y 12, de izquierda a derecha. Prueba t de Student no apareada. *** p < 0,001. c La frecuencia respiratoria máxima. N = 16 y 12, de izquierda a derecha. Prueba t de Student no apareada. *** p < 0,001. d producción de ATP. N = 16 y 13, de izquierda a derecha. Prueba t de Student no apareada. *** p < 0,001. e La capacidad de respiración de repuesto. N = 16 y 11, de izquierda a derecha. Prueba t de Student no apareada. ** p < 0,01. f La tasa de consumo de oxígeno en células HEK293T tratadas con EA. N = 3-4. g La tasa de respiración basal. N = 9, 7 y 10, de izquierda a derecha. ANOVA unidireccional con prueba de Dunnett. *p < 0,05, ***p < 0,001. h La frecuencia respiratoria máxima. N = 9, 7 y 10, de izquierda a derecha. ANOVA unidireccional con prueba de Dunnett. ** p < 0,01, *** p < 0,001. i producción de ATP. N = 9, 7 y 10, de izquierda a derecha. ANOVA unidireccional con prueba de Dunnett. *** p < 0,001. ns, sin significación estadística. j La capacidad de respiración de reserva. N = 9, 7 y 10, de izquierda a derecha. ANOVA unidireccional con prueba de Dunnett. *p < 0,05, ***p < 0,001. k La tasa de consumo de oxígeno en células HEK293T tratadas con MDSA. N = 3-5. l La tasa de respiración basal. N = 10, 9 y 10, de izquierda a derecha. ANOVA unidireccional con prueba de Dunnett. ** p < 0,01, *** p < 0,001. m La frecuencia respiratoria máxima. N = 9, 9 y 10, de izquierda a derecha. ANOVA unidireccional con prueba de Dunnett. *** p < 0,001. n Producción de ATP. N = 9, 9 y 10, de izquierda a derecha. ANOVA unidireccional con prueba de Dunnett. ** p < 0,01, *** p < 0,001. o La capacidad de respiración sobrante. N = 9, 9 y 10, de izquierda a derecha. ANOVA unidireccional con prueba de Dunnett. *** p < 0,001. Las barras de error son la media ± SD. Oligo Oligomicina, FCCP Cianuro de carbonilo-4 (trifluorometoxi) fenilhidrazona, Rot/Ant Rotenona/Antimicina A.

El OCR se redujo en las células tratadas con EA de manera dependiente de la dosis (Fig. 6f), al igual que la respiración inicial y máxima (Fig. 6g, h), la síntesis de ATP (Fig. 6i) y la capacidad de respiración de repuesto (Fig. . 6j), lo que sugiere que EA, al inhibir ME2, reduce considerablemente la respiración celular y la síntesis de ATP. MDSA también tuvo el mismo tipo de efectos que EA (Figs. 6k–6o) pero fue aún más efectivo; por ejemplo, reducir la síntesis de ATP con MDSA requiere 25 µM (Fig. 6n), mientras que con EA requiere más de 25 µM (Fig. 6i).

Además, se realizaron experimentos de OCR para evaluar la eficacia de EA o MDSA en líneas celulares cancerosas H1299 y MCF-7 (Figs. 5e-n y S13e-n, respectivamente). Era evidente que EA inducía cambios de OCR en las células H1299 (Fig. 5e), como lo indica una disminución en la respiración basal y máxima (Fig. 5f, g, respectivamente), la producción de ATP (Fig. 5h) y la respiración de repuesto. capacidad (Fig. 5i). MDSA indujo alteraciones de OCR similares en células H1299 como EA (Fig. 5j), como lo demuestra una disminución en la respiración basal y máxima y la producción de ATP (Figs. 5k-m, respectivamente), pero no la capacidad de respiración adicional (Fig. 5n ). Las células MCF-7, a diferencia de las células H1299, no fueron sensibles a EA o MDSA en respuesta a OCR (Fig. S13e, j, respectivamente); la respiración basal y máxima, la producción de ATP y la capacidad de respiración adicional no cambiaron al tratar con EA o MDSA (Fig. S13f-i y S13k-n, respectivamente); este hallazgo correspondía al hecho de que las células MCF-7 no respondían al metabolismo dirigido por ME2 con EA o MDSA (Fig. S13a-d).

Investigamos los efectos de EA o MDSA en la migración e invasión de células cancerosas H1299 y MCF-7 (Fig. 7 y S15). El ensayo de cicatrización de heridas reveló que EA y MDSA pueden inhibir la migración de células H1299 (Fig. 7a y S15a, respectivamente). La tasa relativa de curación de heridas de las células H1299 tratadas con EA o MDSA fue más lenta que la de las células no tratadas (Figs. 7b, c, respectivamente). Por el contrario, EA y MDSA no pueden inhibir la migración de células MCF-7 (Figs. 7d y S15b, respectivamente). Se observaron tasas de curación de heridas similares entre las células MCF-7 tratadas con EA o MDSA y las células no tratadas (Fig. 7e, f, respectivamente).

a Migración celular (ensayo de cicatrización de heridas) de células H1299 con EA. b Análisis cuantitativo de las tasas relativas de cicatrización de heridas de células H1299 en ausencia o presencia de EA. N = 3. Prueba t de Student no apareada. * p < 0,05. c Análisis cuantitativo de las tasas relativas de curación de heridas de las células H1299 en ausencia o presencia de MDSA. N = 4. Prueba t de Student para datos no apareados. ** p < 0,01. d Ensayo de cicatrización de heridas de células MCF-7 con EA. e Análisis cuantitativo de las tasas relativas de cicatrización de heridas de las células MCF-7 en ausencia o presencia de EA. N = 4. Prueba t de Student para datos no apareados. ns, sin significación estadística. f Análisis cuantitativo de las tasas relativas de cicatrización de heridas de las células MCF-7 en ausencia o presencia de MDSA. N = 4. Prueba t de Student para datos no apareados. ns, sin significación estadística. g Invasión celular de células H1299 con EA. h Cambios en el pliegue de las células H1299 invasivas en ausencia o presencia de EA. N = 3. Prueba t de Student no apareada. * p < 0,05. Cambios en el pliegue de las células H1299 invasivas en ausencia o presencia de MDSA. N = 3. Prueba t de Student no apareada. * p < 0,05. j Invasión celular de células MCF-7 con EA. k Cambios en el pliegue de las células MCF-7 invasivas en ausencia o presencia de EA. N = 3. Prueba t de Student no apareada. ns, sin significación estadística. l Cambios en el pliegue de las células MCF-7 invasivas en ausencia o presencia de MDSA. N = 4. Prueba t de Student para datos no apareados. ns, sin significación estadística. Las barras de error son la media ± SD.

El ensayo de invasión demostró que EA y MDSA pueden inhibir la invasión celular de células H1299 (Fig. 7g y S15c, respectivamente). Los cambios de pliegue de las células invasivas en las células H1299 tratadas con EA o MDSA fueron menores que los de las células no tratadas (Fig. 7h, 7i, respectivamente). Sin embargo, ni EA ni MDSA inhiben la invasión de células MCF-7 (Fig. 7j y S15d, respectivamente). El número de células invasoras en las células MCF-7 no ha cambiado considerablemente después del tratamiento con EA o MDSA (Figs. 7k, l, respectivamente). En conclusión, EA o MDSA inhiben el metabolismo asociado con ME2, particularmente el metabolismo energético, lo que sugiere que la inhibición de la migración e invasión celular por EA o MDSA puede atribuirse a la supresión de la producción de energía en las células cancerosas.

ME2 se ha cristalizado en formas abiertas y cerradas con varios ligandos asociados con el centro activo, el sitio alostérico y el sitio exo10,11,42,43. Nuestro laboratorio determinó previamente las estructuras cristalinas de ME2, lo que reveló que la estructura del mutante ME2_R67Q era una "forma muerta" inactivante de la enzima, mientras que la estructura de ME2_R484W era una "forma cerrada" sobreactivante44. Además, ME2 es un dímero de dímeros, en el que cada monómero comprende cuatro dominios distintos (Dominios A, B, C y D). El dominio A (residuos 23–130) está involucrado en la tetramerización y en la catálisis. Un fumarato activador alostérico se une a la interfaz de dímero de ME2 que contiene el dominio A. Las mutaciones en el sitio de unión del fumarato y el dominio A frecuentemente dan como resultado la inactivación de la enzima44.

En este artículo, informamos que tres estructuras crio-EM de ME2: una forma abierta del complejo binario ME2 que contiene solo NAD+ (Fig. 8a) y dos complejos ternarios ME2 que contienen EA o MDSA y NAD+ (ME2-EA-NAD+ o ME2 -complejos MDSA-NAD+ (Figuras 8b, c, respectivamente). Con base en estas estructuras crio-EM, podemos concluir que EA y MDSA son inhibidores alostéricos en lugar de inhibidores del sitio activo, ya que se unen a la interfaz de dímero cerca del sitio de unión de fumarato de ME2 (Fig. 1), y la unión de EA o MDSA evita que ME2 cambie entre sus formas abierta y cerrada, lo que inhibe su actividad. EA y MDSA tienen modos de unión únicos que se superponen con el modo de unión del fumarato en este sitio alostérico (Fig. 2). Fumarato, un activador alostérico, puede aumentar en gran medida la actividad de ME2 al reducir K0.5,malato y Km,NAD, mejorando así la afinidad de ME2 por sus sustratos (Fig. 8d y Tabla S3). Sin embargo, a diferencia de la unión de fumarato, que puede inducir a ME2 a pasar de una forma abierta a una cerrada, la unión de EA o MDSA evita que ME2 cambie de una forma abierta a una cerrada (Figs. 8b, c), lo que inhibe la actividad de la enzima ME2. Por lo tanto, a pesar de la adición de piruvato, Mg2+, NAD+ y EA (o MDSA) durante la preparación de muestras crio-EM, no obtuvimos un complejo pentario ME2 con piruvato, NAD+, Mg2+ y EA (o MDSA). Esto puede deberse a que la unión de EA o MDSA bloquea la conformación ME2, lo que hace que el sitio activo no sea adecuado para la unión de piruvato y Mg2+. La inhibición de ME2 por EA o MDSA es reversible, y el fumarato puede restaurar la actividad de ME2 que ha sido inhibida por EA o MDSA al competir por el sitio alostérico en la interfaz del dímero (Fig. 8b, d)44. La actividad de ME2 convierte el L-malato en piruvato, que ingresa al ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) y luego produce ATP a través de la cadena de respiración; por lo tanto, cuando aumenta [ATP], se inhibe la actividad de ME2 (Fig. 8e).

a El complejo binario ME2-NAD+ presenta una forma abierta inactiva. b Los complejos ternarios ME2-NAD+-EA yc ME2-NAD+-MDSA también presentan una forma abierta inactiva. EA o MDSA pueden unirse al sitio alostérico en la interfaz del dímero, inhibiendo la actividad de ME2 al inhibir la unión de sustratos de ME2 y, por lo tanto, estabilizando ME2 en una forma abierta inactiva. d El complejo pentario ME2-NAD+-PYR-Mn2+-FUM (código PDB: 1PJ3) muestra una forma cerrada activa, y e El complejo pentario ME2-ATP-MAL-Mn2+-FUM (código PDB: 1PJ4) muestra una forma cerrada inactiva . Para activar la actividad de ME2, el fumarato puede unirse al sitio alostérico en la interfaz del dímero, lo que promueve la unión de los sustratos de ME2 y, por lo tanto, estabiliza a ME2 en una forma cerrada completamente activa. Sin embargo, cuando el nivel celular de ATP aumenta, el ATP puede competir con NAD+ para unirse al sitio activo y al exositio, inhibiendo la actividad de ME2 y manteniendo ME2 en un estado cerrado inactivo. Fumarato FUM, piruvato PYR.

El mecanismo de regulación de ME2 es bastante similar al de la fosfofructoquinasa (FPK), a pesar de que ambas enzimas están localizadas en lugares diferentes; ME2 se localiza en las mitocondrias, mientras que PFK se localiza en el citosol (Fig. 9a). De varias condiciones fisiológicas, ATP es el inhibidor alostérico más efectivo de ME2 y PFK. La glucólisis genera ATP citosólico; cuando los niveles de ATP son altos, el ATP inhibe la PFK, lo que ralentiza la glucólisis. La PFK está inactiva a menos que la célula produzca fructosa-2,6-bisfosfato, su activador alostérico que se une a la PFK y la activa para iniciar la glucólisis. Cuando se agota el [ATP], la fructosa-2,6-bifosfato se une a la PFK para reactivar la enzima mediante la reducción de la Km de los sustratos de la PFK, seguido por el reinicio de la glucólisis. De manera similar, cuando los niveles de ATP mitocondrial aumentan, el ATP inhibe ME2, lo que disminuye la producción de piruvato (Fig. 8e). ME2 también está inactivo hasta que la célula produce su fumarato de activadores alostéricos, que se une a ME2 y lo activa para generar piruvato mitocondrial (Fig. 8d). ME2 puede estar involucrado en la glutaminólisis, y la reacción de ME2 produce piruvato mitocondrial, que luego se convierte en acetil-CoA, que luego se usa para generar ATP adicional a través del ciclo TCA y la fosforilación oxidativa mediada por la cadena de transporte de electrones (Fig. 9a). Fumarato es un componente del ciclo TCA. Cuando se agota [ATP], el fumarato se une a ME2 y lo reactiva (Figs. 8d, e), reintroduciendo NAD+ en el sitio activo y, en última instancia, produciendo piruvato para la síntesis de ATP. Por tanto, tanto ME2 como PFK son enzimas sensibles a la energía cuya actividad está regulada por el estado energético de la célula. ME1 no está regulada por ATP, lo que indica que no es una enzima sensible a la energía.

a Un vínculo entre la reacción catalizada por ME2, el ciclo del ácido tricarboxílico (TCA) y la fosforilación oxidativa mediada por la cadena de transporte de electrones. b Cambios metabólicos inducidos por ME2 en las células mediante la regulación ascendente o descendente de ME2 y mediante el tratamiento con los inhibidores alostéricos de ME2 EA y MDSA.

El piruvato se puede obtener de dos fuentes: el piruvato derivado de glucosa del citosol y la conversión catalizada por ME2 de L-malato mitocondrial en piruvato. El L-malato se puede producir en las mitocondrias a través de la glutaminólisis, la transaminación o la lanzadera de malato-aspartato, entre otros procesos (Fig. 9a). La sobreexpresión de ME2 provoca un aumento en los niveles de piruvato, NADH y ATP, así como una disminución en la relación NAD+/NADH, lo que indica que ME2 es esencial para el metabolismo energético (Fig. 9b). El aumento de la actividad de ME2 en las mitocondrias aumenta el nivel de NADPH allí para contrarrestar la producción de ROS, lo que representa una función única de ME2 en las mitocondrias, mientras que la PFK en el citosol carece de capacidad antioxidante (Fig. 9). El silencio de ME2, por otro lado, da como resultado una disminución en los niveles de piruvato y NADH, así como un aumento en la relación NAD+/NADH, en comparación con el grupo control. La reducción de los niveles de NADPH da como resultado un aumento en la producción de ROS (Fig. 9b). Mecánicamente, el silencio de ME2 da como resultado una disminución en la producción de ATP, la respiración basal y máxima, así como la capacidad de respiración adicional en la célula, lo que indica que las reacciones catalizadas por ME2 son cruciales para la respiración celular y la fosforilación oxidativa allí, como lo demuestran los resultados de este estudio. estudio (Figs. 4-6).

Aquí, informamos el descubrimiento de dos inhibidores alostéricos de ME2, EA y MDSA, que son capaces de inhibir la actividad de ME2 y, por lo tanto, disminuir la producción de piruvato celular, NADH y ATP. El tratamiento con EA o MDSA da como resultado una disminución de la respiración celular y la fosforilación oxidativa en la célula (Fig. 9b). El tratamiento con EA o MDSA también tiene el efecto adicional de disminuir la producción de NADPH, lo que eleva el nivel de ROS en la célula, lo que puede provocar la muerte celular. En otras palabras, la capacidad antioxidante de ME2 es suprimida por EA y MDSA, lo que conduce a una disminución de NADPH y un aumento de ROS. Por lo tanto, ME2 tiene dos funciones en las mitocondrias: la primera es producir piruvato y NADH para generar ATP a través de la fosforilación oxidativa, y la segunda es generar NADPH para contrarrestar ROS.

ME1, en contraste con ME2, carece de un sitio alostérico y no tiene especificidad de cofactor dual; en cambio, utiliza solo NADP+ como cofactor. Por lo tanto, es comprensible que ME2 fuera más susceptible a la inhibición por EA o MDSA que ME1 in vitro (Fig. S1a). Debido a que se ha descubierto que EA o MDSA se unen a ME2 en el sitio alostérico, es posible que el sitio objetivo de EA o MDSA en ME1 esté ubicado en el sitio activo. Esto es ventajoso en términos de especificidad para la inhibición alostérica de ME2 por EA o MDSA. También implica que la disminución en la producción de ATP derivado del malato se debe a la inhibición de ME2 inducida por EA o MDSA. Además, aunque el tratamiento con EA y MDSA redujo la producción de piruvato, esto se logró principalmente a través de la inhibición de la actividad de ME2, más que a través de la inhibición de la glucólisis, que es la vía principal para la producción de piruvato. Como lo demuestra el hecho de que los niveles de PEP y glucosa no cambiaron como resultado del tratamiento (Fig. S14), la inhibición de ME2 por EA o MDSA no afecta la glucólisis.

Durante mucho tiempo se ha sospechado que ME2 es un oncogén, pero no se ha encontrado que ningún inhibidor de molécula pequeña sea eficaz para inhibir la actividad de ME2 y provocar la muerte celular. Hemos demostrado previamente que EA puede inducir la senescencia celular en la línea celular H1299, que es una célula de adenocarcinoma de pulmón41. EA y MDSA son efectivos para inhibir la actividad de ME2 en concentraciones submicromolares, pero las células requieren concentraciones micromolares para prevenir el metabolismo energético y del piruvato impulsado por ME2. Como resultado, optimizar la captación de EA y MDSA en las células es una prioridad para la investigación futura de enfermedades asociadas con ME2.

La proteína ME2 humana se expresó en la tinción de Escherichia coli BL21 utilizando el vector PRH281 bajo el control del promotor trp, que se indujo con ácido indol-3-acético (IAA). ME2 se purificó mediante cromatografía de afinidad de agarosa ATP (Sigma, St Louis, MO, EE. UU.). La proteína ME1 humana se expresó en Escherichia coli BL21(DE3) utilizando el vector pET21b bajo el control del promotor T7, que se indujo con isopropil-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG). ME1 se purificó mediante cromatografía de afinidad con agarosa Ni-NTA (Sigma, St Louis, MO, EE. UU.). Utilizando un dispositivo Amicon®Ultra-15 de corte de 30 KDa, las enzimas málicas purificadas se dializaron y concentraron frente a un tampón de almacenamiento que contenía Tris-HCl 30 mM (pH 7,4) y mercaptoetanol 2 mM (Merck Millipore, Billerica, MA, EE. UU.). La pureza de la proteína se determinó usando SDS-PAGE, y la concentración de la proteína se determinó usando un tampón de ensayo de proteína comercial (Bio-Rad lab, Inc., Hercules, CA, EE. UU.) basado en el método de Bradford, y la absorbancia a 595 nm se detectó utilizando un lector de microplacas multimodo Biotek® (Agilent, Santa Clara, CA, EE. UU.).

La inhibición de ME2 se determinó valorando EA o MDSA de 0 a 40 μM en un tampón de reacción que contenía Tris-HCl 50 mM (7.4), L-malato 40 mM, NAD+ 2 mM y MgCl2 10 mM; La inhibición de ME1 se determinó en un tampón de reacción que contenía Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), L-malato 15 mM, NADP+ 0,2 mM y MgCl2 10 mM. La inhibición de los derivados del ácido disalicílico y naftoico contra ME2 se determinó valorando un rango de concentraciones de inhibidor (0 a 500 μM) mientras se mantenían los sustratos de ME2 en L-malato 40 mM, NAD+ 2 mM y MgCl2 10 mM. Para obtener el valor de IC50, la curva de inhibición se puede calcular utilizando la siguiente ecuación:

donde A denota la concentración de inhibidor. La actividad enzimática residual (%) se normaliza usando la curva de máximo (100%) a mínimo (0%). La pendiente de la curva en su punto medio se llama ladera. El valor IC50 indica la concentración de inhibidor que inhibe el 50% de la actividad de la enzima. Se utilizó Prism 8.0 para realizar todos los cálculos (GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU.).

El plásmido pRH281-ME2 se amplificó usando cebadores mutagénicos (Tabla S4) durante 16–18 termociclos con una ADN polimerasa de alta fidelidad pfuUltra (Agilent, Santa Clara, CA, EE. UU.). Después de la digestión con la enzima de restricción DpnI (TaKaRa, Shiga, Japón) para eliminar el plásmido de plantilla de tipo salvaje, los productos de ADN se transformaron en Escherichia coli XL-10. Finalmente, se utilizó la autosecuenciación para identificar mutantes simples de ME2.

Las muestras de Cryo-EM se prepararon utilizando un Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) ajustado a 4 °C y 100 % de humedad. Se aplicó una solución de muestras purificadas (ME2, ME2-EA o ME2-MDSA sin inhibidores) en una alícuota (3,5 μl) a una rejilla de carbón perforado Quantifoil R1.2/1.3 con descarga luminiscente (Quatifoil GmbH, Alemania). Después de una espera de diez segundos, las rejillas se secaron con papel de filtro y se sumergieron inmediatamente en etano líquido enfriado con nitrógeno líquido. Las rejillas se transfirieron durante 3,0 s con una fuerza de transferencia de 0 para el complejo ME2-EA (1 mg/ml) y el complejo ME2-MDSA (0,5 mg/ml). En el caso de ME2 (1 mg/ml) sin inhibidor, la rejilla se secó durante 3,5 s con una fuerza de transferencia de 5. A continuación, las rejillas crio-EM se vitrificaron y almacenaron en nitrógeno líquido hasta la obtención de imágenes.

Para comenzar, las rejillas crio-EM se inspeccionaron utilizando un microscopio electrónico de transmisión Talos Arctica de 200 kV equipado con un detector Falcon III (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). Las imágenes se capturaron en modo lineal con un aumento nominal de 92 000×, lo que corresponde a un tamaño de píxel de 1,1 Å/píxel y una configuración de desenfoque de −3,0 μm. Las rejillas crio-EM adecuadas se almacenaron y recuperaron en nitrógeno líquido hasta que se recopilaron los datos utilizando el microscopio electrónico de transmisión Titan Krios (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.). El conjunto de datos de alta resolución se recopiló automáticamente en un Titan Krios de 300 kV (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) equipado con una fuente de electrones X-FEG utilizando el software EPU-2.7.0. Para los complejos ME2-EA y ME2-MDSA, los datos se recopilaron utilizando un detector K2 Summit en modo de conteo (lente de pistola 4, tamaño de punto 6, apertura C2 de 50 μm) equipado con filtros de energía GIF Bio-Quantum de Gatan. Las pilas de películas sin procesar se capturaron con un aumento nominal de 165 000×, lo que corresponde a un tamaño de píxel de 0,82 Å/píxel. El rango de desenfoque se estableció en -1,5 a -2,25 μm, y el ancho de la rendija de los filtros de energía se estableció en 20 eV. Se registraron sesenta fotogramas de pilas tiff normalizadas sin ganancia a una tasa de dosis de ~11 e-/Å2 por segundo durante un tiempo de exposición total de 4,5 s, lo que resultó en una dosis acumulada de ~50 e-/Å2 (~0,83 e- /Å2 por cuadro). Al igual que con ME2, los datos se recopilaron utilizando el detector K3 Summit (equipado con filtros de energía GIF Bio-Quantum, Gatan) en modo de súper resolución (lente de pistola 4, tamaño de punto 5, apertura C2 de 50 μm). Las pilas de películas sin procesar se capturaron con una ampliación nominal de 81 000×, lo que corresponde a un tamaño de píxel de 1,061 (superresolución de 0,5305 Å/píxel). El rango de desenfoque se ajustó a -1,5 a -2,5 μm, y el ancho de la rendija de los filtros de energía se ajustó a 20 eV. Se registraron cuarenta fotogramas de pilas tiff normalizadas sin ganancia a una tasa de dosis de ~14 e-/Å2 por segundo durante un tiempo de exposición total de 2,8 s, lo que resultó en una dosis acumulada de ~40 e-/Å2 (~ 1 e- /Å2 por cuadro). Los parámetros utilizados para adquirir datos crio-EM se resumen en la Tabla S2 complementaria.

Todas las pilas de imágenes ME2-EA o ME2-MDSA adquiridas en el modo de conteo se importaron a Relion para la corrección de movimiento y la ponderación de la dosis mediante MotionCor246 con un parche de 5 × 5 sin binning (lo que da como resultado un tamaño de píxel de 0,82 Å/píxel). MotionCor246 se utilizó para corregir el movimiento y ponderar la dosis de las pilas de imágenes ME2 sin inhibidores en modo de superresolución utilizando un parche de 5 × 5 y binning doble (lo que da como resultado un tamaño de píxel de 0,83 Å/píxel). La función de transferencia de contraste (CTF) se calculó a partir de las imágenes utilizando CTFFIND4.1 después de la corrección del movimiento y la ponderación de la dosis47. Todas las partículas se extrajeron semiautomáticamente usando cisTEM48, y las coordenadas de partículas seleccionadas luego se importaron a Relion 3.049 para la extracción de partículas usando un tamaño de caja de 384 píxeles (para complejos ME2-EA y ME2-MDSA) y 256 píxeles (para complejos sin inhibidor). ME2). Se utilizaron varias rondas de clasificación 2D en Relion 3.049 para eliminar los promedios de clase 2D insatisfactorios, seguidos de la selección y extracción de partículas. Las partículas clasificadas en la ronda final de clasificación 2D se transfirieron a cryoSPARC50 para generar mapas ab initio. Después de eso, los mapas ab initio se importaron a Relion49 y se usaron como referencias iniciales para la clasificación 3D (separados en 3 clases). Se utilizó el refinamiento automático 3D con simetría D2 para refinar las bonitas clases 3D. Después del refinamiento CTF y el pulido bayesiano, las partículas brillantes pulidas se importaron a cryoSPARC50 para una clasificación 2D adicional y un refinamiento heterogéneo 3D sin imponer simetría (C1). Después de un refinamiento homogéneo y no uniforme con simetría D2, las partículas pertenecientes a las clases 3D finas se refinaron a una resolución más alta. En cryoSPARC, se agudizó el mapa y se estimó la resolución50. La resolución general se determinó utilizando el criterio de correlación de Fourier Shell (FSC) = 0,143, mientras que la resolución local también se determinó utilizando cryoSPARC50. Se utilizó UCSF Chimera para visualizar mapas de densidad en 3D51. La figura S2 resume los detalles de la reconstrucción crio-EM. Los procedimientos para procesar imágenes de partículas individuales se resumen en las Figs. S3–S5. La Tabla S2 resume los datos estadísticos para las reconstrucciones crio-EM.

Para construir los modelos atómicos para los mapas crio-EM de ME2 libre de inhibidores (2,72 Å), ME2-EA (2,72 Å) y ME2-MDSA (2,84 Å), la estructura atómica de ME2 humano (PDB ID: 1QR6) encajaba rígidamente en los mapas crio-EM. Las diferencias conformacionales se ajustaron manualmente en el programa COOT52 usando las funciones "Zona de refinamiento del espacio real" en la utilidad "Modelar/Ajustar/Refinar" con las restricciones "Torsión", "Péptido plannar", "Péptido trans" y "Ramachandran". . A continuación, se utilizó la función de "refinamiento del espacio real" de PHENIX para optimizar aún más el modelo atómico53, que incluía el modelo atómico de entrada, el mapa crio-EM y la válvula de resolución estimada utilizando el FSC estándar de oro. Después de la inspección visual en COOT del modelo atómico optimizado PHENIX, las regiones problemáticas y los valores atípicos de Ramachandran se corrigieron manualmente utilizando la "Zona de refinamiento del espacio real". Se realizaron numerosas ejecuciones de "refinamiento en espacio real" del modelo atómico en COOT y PHENIX hasta que no se obtuvo ninguna mejora adicional. No modelamos residuos con densidad faltante en los extremos N y C. La parte del resto de mononucleótido de nicotinamida (NMN) de la densidad electrónica de NAD+ está mal resuelta, por lo que modelamos esta región principalmente en base a las restricciones geométricas. Interesante, parte de la densidad de MDSA está relativamente desaparecida en el mapa de nitidez. Para el modelado de MDSA, parte de la densidad de MDSA se pierde en el mapa nítido, pero se puede observar en el mapa no nítido (Fig. S16). La densidad electrónica de la mitad de la molécula de MDSA que mira hacia el sitio de unión está menos definida que la mitad del sitio de unión. Primero colocamos la mitad de MDSA en el sitio de unión según la densidad bien definida y la otra mitad según las restricciones químicas y la densidad rastreable del mapa sin forma. Vale la pena mencionar que la densidad menos definida desapareció en el mapa nítido, lo que sugiere un factor B diferente dentro de MDSA y la mitad que mira hacia el sitio de unión es más flexible. La función de "Validación completa (cryo-EM)" de PHENIX se utilizó para validar el modelo atómico. La Tabla S2 resume las estadísticas de validación.

Se adquirieron células de riñón embrionario humano 293 (HEK293T) de Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, EE. UU.); Se adquirieron dos células de fibroblastos de pulmón fetal humano (HFL-1 y MRC-5) y células de adenocarcinoma de mama humano (MCF-7) del Centro de investigación y colección de recursos biológicos (BCRC, Hsinchu, Taiwán). La línea celular de cáncer de pulmón de células no pequeñas humanas H1299 se adquirió de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE. UU.). Las células HEK293T, HFL-1, MRC-5 y MCF-7 se cultivaron en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (HyCloneTM, Cytiva, Marlborough, MA, EE. UU.) que contenía suero bovino fetal al 10 % (FBS; Sigma, St Louis , MO, EE. UU.) y penicilina/estreptomicina al 1%; la célula H1299 se cultivó en RPMI (HyCloneTM, Cytiva, Marlborough, MA, EE. UU.) que contenía FBS al 10 % y penicilina/estreptomicina al 1 %. Todas las líneas celulares se incubaron a 37 °C en una incubadora humidificada que contenía 5 % de CO2.

Aproximadamente un 70 % de células HEK293T confluentes (1 × 106 células) en una placa de 6 cm se transfectaron con pcDNA3.1-empty (vector de columna vertebral) y pcDNA3.1-ME2 mediante un reactivo de transfección TransIT-X2® (Mirus Bio LLC, WI , EE. UU.) con medio opti-MEMTM (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU., Waltham, MA, EE. UU.) durante 24 h a 37 °C en una incubadora humidificada que contiene 5 % de CO2. El pcDNA3.1-empty (Plasmid #52535) se adquirió de Addgene (Cambridge, MA, EE. UU.) y el pcDNA3.1-ME2 se construyó insertando el gen ME2 en el vector. Se usó inmunotransferencia para determinar el nivel de expresión de ME2 en la célula.

La partícula de transfección lentiviral se usó para administrar el vector lentiviral pLKO_005 con ARN de horquilla corta (shRNA). Los vectores de control pLKO-shCon (TRC2.Void, ASN0000000001) y pLKO-shME2 (TRCN0000294007) se obtuvieron de National RNAi Core Facility (Academia Sinica, Taipei, Taiwán) y las secuencias de horquilla de shRNA fueron las siguientes: shCon, 5′ -CCGGAGTTCAGTTACGATATCATGTCTCGAGACATTCGCGAGTAACTGAACTTTTTT-3′; shME2: 5′- CCGGAGTTCTTACAGAGCTACTAAACTCGAGTTTAGTAGCTCTGTAAGAACTTTTTTG-3′. En placas de 6 pozos, aproximadamente 30% de células HEK293T confluentes (3 × 105 células/pocillo) se trataron durante 48 h con una solución de partículas lentivirales a 37 °C en una incubadora humidificada que contenía 5% de CO2. Se utilizó puromicina (3 µg/ml) para eliminar las células no transfectadas. Usando inmunotransferencia, se determinó el nivel de expresión de ME2 en la célula.

Las concentraciones de piruvato celular y NADPH se determinaron con el kit de ensayo colorimétrico/fluorométrico de piruvato y el kit de ensayo fluorométrico de cuantificación de NADPH PicoProbe™, respectivamente (K609-100 y K349-100; BioVision, Milpitas, CA, EE. UU.). En placas de 6 cm, HEK293T (1,5 × 106 celdas), MRC-5 (3 × 105 celdas), HFL-1 (3 × 105 celdas) y H1299 (3 × 105 celdas) y MCF-7 (6 × 105 celdas) se cultivaron durante 24 h en medio que contenía L-malato 20 mM a 37 °C con 5% de CO2. Las células se trataron con EA o MDSA durante 48 h. Después de la recolección, las células se sonicaron en 100 µl de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Después de la centrifugación, el sobrenadante se desproteinizó con una columna giratoria de 10 kDa (filtro de jeringa Acrodisc®, Pall Life Sciences) y se analizó con mezclas de trabajo en una placa de 96 pocillos con el lector de microplacas multimodo Biotek® para detectar la fluorescencia en Ex/Em. =535/587 nm (Agilent, Santa Clara, CA, EE. UU.).

Los niveles de NAD+ y NADH se determinaron mediante el ensayo NAD/NADH-GloTM (G9071; Promega, Madison, WI, EE. UU.). En placas de 6 cm, HEK293T (1,5 × 106 células), HFL-1 (3 × 105 células) y MRC-5 (3 × 105 células) se trataron durante 48 h con 25 µM EA o MDSA a 37 °C con 5 % CO2. HEK293T (2 × 106 células en 100 µL de PBS), HFL-1 y MRC-5 (2 × 105 células en 100 µL de PBS) se sonicaron y los sobrenadantes se desproteinizaron usando la columna giratoria de 10 kDa (filtro de jeringa Acrodisc®, Pall Ciencias de la vida). Los sobrenadantes (2 × 104 células en 100 µL de PBS) se mezclaron con un volumen igual de reactivo de detección en una placa de 96 pocillos y los niveles de NAD+ y NADH se determinaron utilizando señales luminiscentes del lector de microplacas multimodo Biotek® (Agilent, Santa Clara, CA, EE. UU.).

En placas de 6 cm, HEK293T (1,5 × 106 células), HFL-1 (3 × 105 células) y MRC-5 (3 × 105 células) se trataron con 25 µM EA o MDSA a 37 °C con 5 % de CO2 durante 48 H. H1299 (3 × 105 células) y MCF-7 (6 × 105 células) se trataron con EA 150 µM o MDSA a 37 °C con 5 % de CO2 durante 48 h. El contenido de ATP de las células se determinó utilizando un ensayo de viabilidad celular CellTiter-Glo® 2.0 (G9242; Promega, Madison, WI, EE. UU.). Se resuspendieron 2 × 104 células en 100 µL de PBS y se hicieron reaccionar con un volumen igual del tampón de ensayo. La luminiscencia se detectó utilizando el lector de microplacas multimodo Biotek® (Agilent, Santa Clara, CA, EE. UU.). Los niveles intracelulares de ROS se determinaron utilizando un kit de ensayo de detección de ROS (ab287839; Abcam, Cambridge, Reino Unido). Se incubaron 1,5 × 105 células durante 45 min a 37 °C en la oscuridad con un tampón ROS diluido. Después de un lavado con tampón PBS, las células se resuspendieron en 150 µl de tampón ROS y se detectó la fluorescencia a Ex/Em=495/529 nm con el lector de microplacas multimodo Biotek® (Agilent, Santa Clara, CA, EE. EE.UU).

Las células HEK293T (3,75 × 104 células), H1299 (1,75 × 104 células) y MCF-7 (2,8 × 104 células) se sembraron e incubaron en microplacas de cultivo celular Agilent Seahorse XF24 durante 24 h a 37 °C con 5 % de CO2. Luego, las células HEK293T se expusieron a 0, 25 y 50 µM de EA y MDSA durante 4 h, mientras que las células H1299 y MCF-7 se expusieron a 0, 75 y 150 µM de EA y MDSA durante 3 h. Después de 30 min de incubación a 37 °C en una incubadora sin CO2, el medio de crecimiento se reemplazó con un medio base (Agilent, Santa Clara, CA, EE. UU.) que contenía piruvato 1 mM, glutamina 4 mM y D 1 mg/mL. -glucosa. Durante un intervalo de tiempo de 24 min, las células se trataron secuencialmente con oligomicina A 5 µM, FCCP 2 µM y ronstone/antinomicina A 1 µM. La tasa de consumo de oxígeno (OCR) se determinó usando un Seahorse XFe24 Analyzer junto con el Seahorse XF Prueba de estrés celular Mito (Agilent, Santa Clara, CA, EE. UU.). Los datos experimentales se analizaron utilizando el programa de control Wave2.6 (Agilent, Santa Clara, CA, EE. UU.).

La mezcla de reacción para la actividad de la enzima ME2 estaba compuesta por MgCl2 10 mM, L-malato 40 mM y NAD+ 2 mM en Tris-HCl 50 mM (pH 7,4). Los valores de K0.5,malato y Km,NAD se determinaron valorando un rango de concentraciones de L-malato y NAD+, respectivamente, mientras se mantenían niveles saturados de otros compuestos. Se usó un espectrofotómetro UV/VIS (Lambda 25, Perkin Elmer, MA, EE. UU.) para monitorear la actividad enzimática mediante el seguimiento continuo de los aumentos en NADH, que tiene una absorbancia notable a 340 nm. Se utilizó la ecuación de Michaelis-Menten para determinar el valor de Km,NAD, y el coeficiente de extinción de 6,22 mM−1 cm−1 para determinar el valor de kcat. Se utilizó la siguiente ecuación para calcular la cooperatividad del L-malato:

donde v denota la velocidad inicial, Vmax denota la velocidad máxima de la reacción, K0.5 denota la concentración de sustrato a la mitad de la velocidad máxima y h denota el coeficiente de colina, que significa el grado de cooperatividad. Se utilizó Prism 8.0 para realizar todos los cálculos (GraphPad Software, San Diego, CA, EE. UU.). La activación de fumarato se determinó valorando un rango de concentraciones de fumarato (0 a 6 mM) mientras se mantenía L-malato 15 mM, NAD+ 1 mM y MgCl2 10 mM.

Las células se lisaron con tampón RIPA Lysis (Promega, Waltham, MA, EE. UU.). La concentración de proteína de los sobrenadantes se determinó utilizando el método de Bradford después de homogeneizarlos y centrifugarlos. Los sobrenadantes (50 μg) se separaron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a la membrana de transferencia de PVDF. El PVDF se bloqueó con tampón de bloqueo y se incubó durante 24 h a 4 °C con anticuerpos anti-ME2 humanos personalizados (0,5 μg/ml) (MDbio Inc., Taipei, Taiwán) y anticuerpos anti-actina (1 μg/ml) ( Arigo Biolaboratories, Hsinchu, Taiwán), seguido de una hora a 25 °C con el segundo anticuerpo marcado con peroxidasa de rábano picante. Finalmente, los anticuerpos marcados reaccionaron con un tampón de quimioluminiscencia mejorado y la luminiscencia se detectó utilizando un mini generador de imágenes ImageQuantTM LAS 4000 (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ).

El número relativo de células viables en una población se determinó mediante el ensayo de viabilidad celular CellTiter-Fluor™ (G6080, Promega, Madison, WI, EE. UU.). En placas de 96 pocillos, se sembraron 1 × 104 células y se incubaron durante 24 h en 100 µL de medio. Durante 24 h adicionales, las células se trataron con diversas concentraciones de EA y MDSA. Después de reemplazar 50 µL de medio con 50 µL de reactivo de ensayo en cada pocillo, las células se incubaron durante 30 min a 37 °C con 5 % de CO2. La viabilidad de las células se determinó utilizando el lector de microplacas multimodo Biotek® ajustado a Ex/Em=490/505 nm (Agilent, Santa Clara, CA, EE. UU.).

La estructura secundaria de la proteína ME2 se determinó utilizando un espectropolarímetro de dicroísmo circular (CD) Jasco J-815 (Jasco Deutschland GmbH, Pfungstadt, Alemania). Las muestras de proteínas (0,3 mg/ml) en trisacetato 30 mM (pH 7,4) se detectaron utilizando una cubeta de cuarzo con un paso óptico de 0,1 cm y los datos de espectros de CD se recopilaron en incrementos de 0,2 nm entre 190 y 260 nm. Cada espectro de CD se determinó utilizando un promedio de diez escaneos individuales y se normalizó a la concentración de la muestra.

Alrededor del 70 % de células HEK293T confluentes (3 × 106 células) se trataron durante 48 h con EA 50 µM y MDSA a 37 °C en una incubadora humidificada que contenía CO2 al 5 %. Se usaron 4 ml de metanol al 80% (vol/vol) para extraer los metabolitos celulares de las células. Después de desproteinizar con la columna giratoria de 10 kDa (filtro de jeringa Acrodisc®, Pall Life Sciences), la concentración de la solución de extracción se normalizó frente a la concentración de ADN o proteína. La solución de extracción del metabolito se evaporó utilizando un evaporador de nitrógeno para eliminar el metanol y se resuspendió en acetonitrilo (ACN) a una concentración del 20 % (vol/vol). Los experimentos de cromatografía líquida se realizaron en un sistema VanquishTM LC (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) equipado con una columna Cogent Diamond-HydrideTM (150 × 2,1 mm, 4 µm; MicroSolv Technology Corp., Eatontown, NJ, EE. UU.) . La fase móvil estaba compuesta por (A) ácido fórmico al 0,01 % y (B) agua/ACN 90:10 (vol/vol). En este estudio se utilizó el siguiente gradiente: 0-3 min, 20-20% A; 3–9,5 min, 20–30 % A; 9,5–10 min, 30–70 % A; 10-11 min, 70-100% A; 11-14 min, 100-100% A; 14-14,1 min, 100-20% A; 14,1 a 35 min, 20 a 20 % de A. El caudal fue de 0,2 ml/min. Los análisis de espectrometría de masas se realizaron en un espectrómetro de masas de triple cuadrupolo Thermo Fisher Scientific TSQ AltisTM (Waltham, MA, EE. UU.) equipado con una fuente de ionización por electropulverización (ESI) en modo de barrido positivo utilizando el modo de monitoreo de reacción seleccionado (SRM). Los parámetros óptimos fueron los siguientes: caudal de gas envolvente de 35 unidades arbitrarias, caudal de gas auxiliar de 5 unidades arbitrarias, temperatura capilar de 325 °C y voltaje de pulverización de 3,5 kV.

H1299 (1,5 × 105 células) y MCF-7 (3,0 × 105 células) se sembraron en una placa de 24 pocillos Costar® (Corning, NY, EE. UU.) y se cultivaron durante 24 h a 37 °C con 5 % de CO2 para formar un monocapa celular confluente. Una vez que las células alcanzaron la confluencia, se retiró el medio y se usó tampón PBS para lavar las células. A continuación, se rascó la monocapa con una punta de pipeta de 200 µL y se trataron las células con EA o MDSA 150 µM a 37 °C y CO2 al 5 % durante 48 h. Usando un microscopio automatizado Lionheart FX (BioTek®, Agilent, Santa Clara, CA, EE. UU.), se adquirieron y analizaron las imágenes de campo brillante de las células.

Matrigel® (Corning, NY, EE. UU.) se revistió en la cámara superior de una placa Transwell® de 24 pocillos (Corning, NY, EE. UU.) durante 24 h (matrigel de 200 µg/ml para MCF7, matrigel de 1000 µg/ml para H1299) . Matrigel se diluyó con el medio libre de FBS. Después de esto, se sembraron H1299 (1,0 × 105 células) y MCF7 (1,5 × 105 células) en la cámara superior con medio libre de FBS y se trataron durante 24 h con EA 150 µM o MDSA. Mientras tanto, se añadió a la cámara inferior el medio quimioatrayente que contenía FBS al 10 %. Se usó un microscopio invertido (Olympus Corporation, Tokio, Japón) para capturar las imágenes de las células, que luego se analizaron usando Image J54.

Los datos presentados indican medias ± desviaciones estándar (media ± SD). En estos casos, el número de muestras biológicamente independientes es tres o más. El análisis estadístico se realizó utilizando la prueba t de Student de dos colas para datos no apareados o el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) con la prueba de Dunnett a niveles de significación de *p < 0,05, **p < 0,01 y ***p < 0.001.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Las estructuras crio-EM determinadas aquí están depositadas en el Banco de datos de microscopía electrónica (EMDB) con los códigos de acceso EMD-33145 (forma abierta de ME2), EMD-33146 (complejo ME2-EA) y EMD-33147 (complejo ME2-MDSA). ). Los modelos moleculares asociados se depositan en el PDB con el código de acceso 7XDE (forma abierta de ME2), 7XDF (complejo ME2-EA) y 7XDG (complejo ME2-MDSA). Todos los demás datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado, los datos complementarios y los archivos de información complementaria. Los conjuntos de datos generados y analizados durante este estudio están disponibles del autor correspondiente a pedido.

Mallick, S., Harris, BG & Cook, PF Mecanismo cinético de NAD: enzima málica de Ascaris suum en la dirección de la carboxilación reductora. J. Biol. química 266, 2732–2738 (1991).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Cleland, WW Mecanismos de descarboxilación oxidativa enzimática. Cuentas Chem. Res. 32, 862–868 (1999).

Artículo CAS Google Académico

Chang, G.-G. & Tong, L. Estructura y función de las enzimas málicas, una nueva clase de descarboxilasas oxidativas†. Bioquímica 42, 12721–12733 (2003).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Moreadith, RW & Lehninger, AL Purificación, comportamiento cinético y regulación de la enzima málica NAD(P)+ de las mitocondrias tumorales. J. Biol. química 259, 6222–6227 (1984).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Frenkel, R. Regulación y funciones fisiológicas de las enzimas málicas. actual Arriba. Celúla. Reg. 9, 157–181 (1975).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Coltell, O. et al. Estudio de asociación de todo el genoma para ácidos grasos poliinsaturados omega-3 y omega-6 en suero: análisis exploratorio de los efectos específicos del sexo y la modulación dietética en sujetos mediterráneos con síndrome metabólico. Nutrientes 12, 310 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Teller, JK, Fahien, LA & Davis, JW Cinética y regulación de la enzima málica NAD(P) mitocondrial del hepatoma. J. Biol. química 267, 10423–10432 (1992).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Sauer, LA, Dauchy, RT, Nagel, WO y Morris, HP Enzimas málicas mitocondriales. La actividad de la enzima málica dependiente de NAD(P)+ mitocondrial y la formación de piruvato dependiente de malato están ligadas a la progresión en los hepatomas de Morris. J. Biol. química 255, 3844–3848 (1980).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Moreadith, RW & Lehninger, AL Las vías de oxidación del glutamato y la glutamina por las mitocondrias de las células tumorales. Papel de la enzima málica dependiente de NAD(P)+ mitocondrial. J. Biol. química 259, 6215–6221 (1984).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Yang, Z., Floyd, DL, Loeber, G. & Tong, L. Estructura de una forma cerrada de enzima málica humana e implicaciones para el mecanismo catalítico. Nat. Estructura. mol. Biol. 7, 251–257 (2000).

Artículo CAS Google Académico

Yang, Z., Lanks, CW & Tong, L. Mecanismo molecular para la regulación de la enzima málica dependiente de NAD(P)+ mitocondrial humana por ATP y fumarato. Estructura 10, 951–960 (2002).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Hung, H.-C., Kuo, M.-W., Chang, G.-G. y Liu, G.-Y. Caracterización del papel funcional del residuo del sitio alostérico Asp102 en el mecanismo regulador de la malato deshidrogenasa mitocondrial humana dependiente de NAD(P)+ (enzima málica). Bioquímica J. 392, 39 (2005).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hsieh, J.-Y., Liu, G.-Y., Chang, G.-G. & Hung, H.-C. Determinantes de la especificidad del cofactor dual y la cooperación del sustrato de la enzima málica dependiente de NAD(P)+ mitocondrial humano PAPELES FUNCIONALES DE LA GLUTAMINA 362. J. Biol. química 281, 23237–23245 (2006).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Hsieh, J.-Y., Liu, G.-Y. & Hung, H.-C. Factor influyente que contribuye a la inhibición específica de la isoforma por parte del ATP de la enzima málica dependiente de NAD(P)+ mitocondrial humano. FEBS J. 275, 5383–5392 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Hsieh, J.-Y. & Hung, H.-C. Ingeniería de las especificidades del cofactor y la inhibición específica de la isoforma de la enzima málica. J. Biol. química 284, 4536–4544 (2009).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Hsieh, J.-Y., Chiang, Y.-H., Chang, K.-Y. & Hung, H.-C. Papel funcional del sitio de fumarato Glu59 involucrado en la regulación alostérica y la interacción subunidad-subunidad de la enzima málica dependiente de NAD (P) + mitocondrial humana. FEBS J. 276, 983–994 (2009).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Hsieh, J.-Y., Liu, J.-H., Fang, Y.-W. & Hung, H.-C. Funciones duales de Lys (57) en la interfaz del dímero de la enzima málica dependiente de NAD (P) + mitocondrial humana. Bioquímica J. 420, 201–209 (2009).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Hsieh, J.-Y., Chen, M.-C. & Hung, H.-C. Determinantes de la selectividad de unión a nucleótidos de la enzima málica. Más uno. 6, e25312 (2011).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hsieh, J.-Y., Shih, W.-T., Kuo, Y.-H., Liu, G.-Y. & Hung, H.-C. Papeles funcionales de los intermediarios metabólicos en la regulación de la enzima málica dependiente de NAD(P)+ mitocondrial humana. ciencia Rep. 9, 9081 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Chang, Y.-L. et al. La enzima málica dependiente de NAD(P)+ mitocondrial humana participa en la progresión e invasión del melanoma cutáneo. J. invertir. Dermatol. 135, 807–815 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Cheng, C.-P. et al. Los mecanismos de la enzima málica 2 en la tumorigénesis de los gliomas humanos. Oncotarget 7, 41460–41472 (2016).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Usted, D. et al. La enzima málica mitocondrial 2 promueve la metástasis del cáncer de mama mediante la estabilización de HIF-1α en condiciones de hipoxia. Mentón. J. Cáncer Res. 33, 308–322 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sarfraz, I. et al. La enzima málica 2 como posible diana terapéutica de fármacos para el cáncer. Vida IUBMB. 70, 1076–1083 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Académico

MacDonald, MJ, Longacre, MJ y Kendrick, MA Enzima málica mitocondrial (ME2) en islotes pancreáticos de células de insulinoma humano, de rata y de ratón y clonal. Arco Bioquímica. Biografía. 488, 100–104 (2009).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pongratz, RL, Kibbey, RG, Shulman, GI & Cline, GW Las isoformas de enzimas citosólicas y mitocondriales málicas controlan de manera diferencial la secreción de insulina. J. Biol. química 282, 200–207 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Lee, W.-C., Ji, X., Nissim, I. & Long, F. Malic Enzyme Couples Mitochondria with Aerobic Glycolysis in Osteoblasts. Informe celular 32, 108108 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McKenna, MC et al. La actividad de la enzima málica mitocondrial es mucho mayor en las mitocondrias de las terminales sinápticas corticales en comparación con las mitocondrias de cultivos primarios de neuronas corticales o células granulares del cerebelo. Neuroquímica Int. 36, 451–459 (2000).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Greenberg, DA et al. La enzima málica 2 puede ser la base de la susceptibilidad a la epilepsia generalizada idiopática de inicio en la adolescencia. American J. Genética humana. 76, 139–146 (2005).

Artículo CAS Google Académico

Wang, M., Greenberg, DA & Stewart, WCL Replicación, reanálisis y expresión génica: ME2 y epilepsia genética generalizada. Epilepsia 60, 539–546 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Sabio, DR et al. Myc regula un programa transcripcional que estimula la glutaminólisis mitocondrial y conduce a la adicción a la glutamina. PNAS 105, 18782–18787 (2008).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Xu, XD et al. ¿Efecto Warburg o efecto Warburg inverso? Una revisión del cáncer. Metabolismo. ORT. 38, 117–122 (2015).

CAS Google Académico

Fahien, LA & Teller, JK Metabolismo del glutamato-malato en las mitocondrias hepáticas. Un modelo construido sobre la base de los niveles mitocondriales de enzimas, especificidad, constantes de disociación y estequiometría de complejos heteroenzimáticos. J. Biol. química 267, 10411–10422 (1992).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Wang, Y.-P. et al. La enzima málica 2 conecta el fumarato intermedio del ciclo de Krebs con la biogénesis mitocondrial. Metabolismo Celular. 33, 1027–1041.e8 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Loeber, G., Infante, AA, Maurer-Fogy, I., Krystek, E. & Dworkin, MB Enzima málica mitocondrial dependiente de NAD (+) humana. Clonación de ADNc, estructura primaria y expresión en Escherichia coli. J. Biol. química 266, 3016–3021 (1991).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Baggetto, LG Metabolismo energético desviado de las células cancerosas glicolíticas. Biochimie 74, 959–974 (1992).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Dey, P. et al. La eliminación genómica de la enzima málica 2 confiere letalidad colateral en el cáncer de páncreas. Naturaleza 542, 119–123 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jiang, P., Du, W., Mancuso, A., Wellen, KE y Yang, X. La regulación recíproca de p53 y las enzimas málicas modula el metabolismo y la senescencia. Naturaleza 493, 689–693 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jiang, D. & Attardi, LD Activar el freno metabólico p53 conduce a la senescencia. Resolución celular 23, 739–740 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hsieh, J.-Y. et al. Los análogos de fumarato actúan como inhibidores alostéricos de la enzima málica dependiente de NAD(P)+ mitocondrial humana. Más uno. 9, e98385 (2014).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Su, K.-L., Chang, K.-Y. & Hung, H.-C. Efectos de análogos estructurales del sustrato y regulador alostérico de la enzima málica dependiente de NAD(P)+ mitocondrial humana. Bioorgánica Med. química 17, 5414–5419 (2009).

Artículo CAS Google Académico

Hsieh, J.-Y. et al. Un inhibidor de molécula pequeña suprime la enzima málica dependiente de NAD(P)+ mitocondrial asociada al tumor (ME2) e induce la senescencia celular. Oncotarget 6, 20084–20098 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Xu, Y., Bhargava, G., Wu, H., Loeber, G. & Tong, L. Estructura cristalina de la enzima málica dependiente de NAD (P) + mitocondrial humana: una nueva clase de descarboxilasas oxidativas. Estructura 7, 877–889 (1999).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Tao, X., Yang, Z. & Tong, L. Estructuras cristalinas de complejos de sustrato de enzima málica e información sobre el mecanismo catalítico. Estructura 11, 1141–1150 (2003).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Hsieh, J.-Y. et al. Las variantes de un solo nucleótido conducen a la desregulación de la enzima málica mitocondrial humana dependiente de NAD(P)+. iScience 24, 102034 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Murugan, S. y Hung, H.-C. Caracterización biofísica de las interacciones de interfaz de dímero y tetrámero de la enzima málica citosólica humana. Más uno. 7, e50143 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zheng, SQ et al. MotionCor2: corrección anisotrópica del movimiento inducido por haz para mejorar la microscopía crioelectrónica. Nat. Métodos. 14, 331–332 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rohou, A. & Grigorieff, N. CTFFIND4: Estimación de desenfoque rápida y precisa a partir de micrografías electrónicas. J. Estructura. Biol. 192, 216–221 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Grant, T., Rohou, A. & Grigorieff, N. cisTEM, software fácil de usar para el procesamiento de imágenes de partículas individuales. Elife 7, e35383 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Zivanov, J. et al. Nuevas herramientas para la determinación automatizada de estructuras crio-EM de alta resolución en RELION-3. Elife 7, e42166 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Punjani, A., Rubinstein, JL, Fleet, DJ y Brubaker, MA cryoSPARC: algoritmos para la determinación rápida de estructuras crio-EM sin supervisión. Nat. Métodos. 14, 290–296 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Yang, Z. et al. UCSF Chimera, MODELLER e IMP: un sistema de modelado integrado. J. Estructura. Biol. 179, 269–278 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Emsley, P. & Cowtan, K. Coot: herramientas de construcción de modelos para gráficos moleculares. Acta Crystallogr. D Biol. cristalogr. 60, 2126–2132 (2004).

Artículo PubMed Google Académico

Afonine, PV et al. Refinamiento del espacio real en PHENIX para crio-EM y cristalografía. Acta Crystallogr. Estructura D. Biol. 74, 531–544 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schneider, CA, Rasband, WS & Eliceiri, KW NIH Image to ImageJ: 25 años de análisis de imágenes. Nat. Métodos. 9, 671–675 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pettersen, EF et al. UCSF Chimera: un sistema de visualización para investigación y análisis exploratorios. J. Cómputo. química 25, 1605–1612 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Descargar referencias

Este trabajo fue apoyado financieramente por el Ministerio de Ciencia y Tecnología, ROC (MOST 104-2311-B-005-009 -MY3, MOST 110-2311-B-005-007 y 108-2320-B-040-020-MY3 ); parcialmente apoyado por el Centro Avanzado de Biotecnología de Plantas y Cultivos Alimenticios del Programa del Centro de Investigación de Áreas Destacadas en el marco del Proyecto Brote de Educación Superior del Ministerio de Educación (MOE) de Taiwán. Nos gustaría expresar nuestro agradecimiento por la asistencia con el análisis de MS proporcionado por el Centro de Instrumentos de la Universidad Nacional Chung Hsing. Los experimentos crio-EM se realizaron en la Instalación Cryo-EM de la Academia Sínica (ASCEM). ASCEM cuenta con el apoyo conjunto de la Instalación central de Academia Sinica y el Proyecto de instrumentos innovadores (Subvención n.º AS-CFII-111-210) y el Proyecto de proteínas de Taiwán (Subvención n.º AS-KPQ-109-TPP2). Este trabajo utilizó recursos de nube distribuida de ASGC (Academia Sinica Grid-computing Center), que cuenta con el respaldo de Academia Sinica.

Estos autores contribuyeron por igual: Ju-Yi Hsieh, Kun-Chi Chen, Chun-Hsiung Wang.

Departamento de Ciencias de la Vida, Universidad Nacional Chung Hsing, Taichung, 402, Taiwán ROC

Ju-Yi Hsieh, Kun-Chi Chen, Jie-An Ye, Yu-Tung Chou, Yi-Chun Lin, Cheng-Jhe Lyu, Rui-Ying Chang, Yi-Liang Liu y Hui-Chih Hung

Doctor. Programa en Ingeniería de Tejidos y Medicina Regenerativa, Universidad Nacional Chung Hsing, Taichung, 402, Taiwán ROC

Kun-Chi Chen y Hui-Chi Hung

Instituto de Química Biológica, Academia Sinica, Taipei, 115, Taiwán ROC

Chun-Hsiung Wang y Meng-Chiao Ho

Instituto de Medicina, Facultad de Medicina, Universidad Médica de Chung Shan, Taichung, 402, Taiwán ROC

Guang-Yaw Liu y Jie-An Ye

Centro de Instrumentos, Oficina de Investigación y Desarrollo, Universidad Nacional Chung Hsing, Taichung, 40227, Taiwán ROC

Yen-Hsien Li

Departamento de Química, Universidad Nacional Chung Hsing, Taichung, 402, Taiwán ROC

Yen-Hsien Lee y Mau-Rong Lee

Instituto de Ciencias Bioquímicas, Universidad Nacional de Taiwán, Taipei, 106, República de China de Taiwán

Meng-Chiao Ho

Instituto de Genómica y Bioinformática, Universidad Nacional Chung Hsing, Taichung, 402, Taiwán ROC

Hui-Chih Hung

Centro Avanzado de Biotecnología de Plantas y Cultivos Alimenticios, Universidad Nacional Chung Hsing, Taichung, 402, Taiwán ROC

Hui-Chih Hung

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

JYH, CJL, RYC y YLL llevaron a cabo los experimentos cinéticos. CHW llevó a cabo el trabajo estructural. JYH, KCC, JAY, YTC y YCL llevaron a cabo los estudios basados ​​en células. YHL y MRL llevaron a cabo el análisis de espectrometría MASS. JYH, CHW y KCC analizaron los datos y colaboraron en la interpretación de los resultados. HCH, MCH y GYL cosupervisaron el proyecto y contribuyeron a su diseño e implementación, así como a su análisis y redacción del artículo.

Correspondencia con Meng-Chiao Ho o Hui-Chih Hung.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Azhar Rasul, Matthew J. Belousoff y Song Xiang por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editor de Manejo Principal: Joao Valente.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Hsieh, JY., Chen, KC., Wang, CH. et al. La supresión de la enzima málica humana 2 modifica el metabolismo energético e inhibe la respiración celular. Commun Biol 6, 548 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04930-y

Descargar cita

Recibido: 04 Agosto 2022

Aceptado: 12 de mayo de 2023

Publicado: 22 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04930-y

Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenido Springer Nature SharedIt

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y Pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.