Las respuestas Th17 y los anticuerpos IgM naturales están relacionados con la composición de la microbiota intestinal en pacientes con lupus eritematoso sistémico

Informes científicos volumen 6, Número de artículo: 24072 (2016) Citar este artículo

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Se ha notificado disbiosis intestinal, caracterizada por una proporción reducida de Firmicutes/Bacteroidetes, en pacientes con lupus eritematoso sistémico (LES). En este estudio, los cultivos in vitro revelaron que la microbiota aislada de muestras de heces de pacientes con LES (SLE-M) promovió la activación de linfocitos y la diferenciación Th17 de linfocitos CD4+ vírgenes en mayor medida que la microbiota de control sana. El enriquecimiento de SLE-M con bacterias inductoras de Treg mostró que una mezcla de dos cepas de Clostridia redujo significativamente el equilibrio Th17/Th1, mientras que la suplementación con Bifidobacterium bifidum evitó la sobreactivación de linfocitos CD4+, lo que respalda un posible beneficio terapéutico de los probióticos que contienen cepas inductoras de Treg para restaurar el desequilibrio Treg/Th17/Th1 presente en SLE. De hecho, los análisis ex vivo de muestras de pacientes mostraron poblaciones Th17 y Foxp3+ IL-17+ aumentadas, lo que sugiere una posible diferenciación trans Treg-Th17. Además, los análisis de la microbiota fecal revelaron una correlación negativa entre las poblaciones de IL-17+ y Firmicutes en controles sanos, mientras que en el LES este filo se correlacionó directamente con los niveles séricos de IFNγ, una citocina Th1 ligeramente reducida en los pacientes. Finalmente, la frecuencia de Synergistetes, correlacionada positivamente con la relación Firmicutes/Bacteroidetes en controles sanos, tendió a reducirse en pacientes cuando los títulos de anti-dsDNA estaban aumentados y mostró una fuerte correlación negativa con los niveles séricos de IL-6 y se correlacionó positivamente con la protección natural. Anticuerpos IgM contra la fosforilcolina.

El lupus eritematoso sistémico (LES) es una enfermedad autoinmune crónica desencadenada por una combinación de factores ambientales y genéticos que provocan una ruptura de la tolerancia hacia los autoantígenos1. La posterior producción de autoanticuerpos por parte de las células B autorreactivas constituye un factor patológico clave en el LES, ya que conduce a la formación y depósito de inmunocomplejos que provocan daño tisular2. Asimismo, las células CD4+ vírgenes activadas por el reconocimiento de tales autoantígenos pueden diferenciarse en varios subconjuntos según el patrón de citocinas presentes en el entorno local3. Además del conocido paradigma de la respuesta inmune de las células Th1/Th2, hoy en día mucha evidencia revela la presencia de alteraciones en las células Th17 y T reguladoras (Treg) en la enfermedad del LES4,5,6. Con respecto a las células Th17, algunos estudios respaldan su papel fundamental como principales impulsores de las respuestas autoinmunes en el LES a través de la secreción de citoquinas proinflamatorias involucradas en la inflamación local y la destrucción de tejidos, incluidas IL-17, IL-22 e IL-237,8. En consecuencia, recientemente se ha informado de un aumento de los niveles circulantes de IL-17 y de células T productoras de IL-17 en el LES9,10,11. Además, también se ha demostrado que las células T productoras de IL-17 se infiltran en los pulmones, la piel y los riñones en pacientes con lupus, lo que contribuye al daño orgánico10,12. Por el contrario, las células Treg son esenciales para la prevención de enfermedades autoinmunes e inflamatorias, ya que presentan una actividad supresora sobre las respuestas efectoras aberrantes13. Las células Treg naturales emergen del timo y se caracterizan principalmente por la presencia de altos niveles de CD25 (cadena IL2Rα) y FOXP3, un factor de transcripción necesario para el desarrollo y la función de las células Treg14. Además, las células Treg podrían expandirse o inducirse en tejidos periféricos en respuesta a diversos antígenos15. La mayoría de los estudios informan sobre un número reducido o una función alterada de las células Treg circulantes en pacientes con LES16,17,18.

La creciente evidencia sugiere que la composición de la microbiota comensal que coloniza el intestino afecta la diferenciación de las células inmunitarias presentes en los tejidos linfoides asociados al intestino (GALT)19. Específicamente, las células plasmáticas en la lámina propia están involucradas en la producción de anticuerpos independientes de células T contra componentes de bacterias comensales y patógenas, así como contra células apoptóticas, denominadas anticuerpos IgM naturales20. Curiosamente, varios estudios han informado funciones inmunorreguladoras de anticuerpos IgM naturales que inhiben la señalización inflamatoria en células inmunitarias innatas y suprimen enfermedades autoinmunes21,22. Por otro lado, después del reconocimiento de los antígenos bacterianos, las células dendríticas intestinales (DC) pueden inducir la diferenciación de las células T CD4+ vírgenes en diferentes tipos de células T efectoras o reguladoras23,24,25,26. En condiciones fisiológicas, la microbiota normal presentada en individuos sanos favorece el mantenimiento de la homeostasis inmune intestinal27. Por el contrario, varios estudios sugieren que las alteraciones en la composición de la microbiota intestinal, conocidas como disbiosis, pueden ser un factor crítico en el desarrollo de numerosas patologías inmunomediadas, probablemente en huéspedes susceptibles a la enfermedad, a través de la generación de un desequilibrio entre las células Th y Treg19 ,28,29,30,31. En este sentido, la disbiosis intestinal se ha asociado con el desarrollo de diversas enfermedades autoinmunes, entre ellas la enfermedad inflamatoria intestinal, la diabetes tipo 1, la artritis reumatoide y la esclerosis múltiple32,33,34,35,36,37,38. En este sentido, recientemente hemos descrito una disbiosis intestinal asociada a LES caracterizada por una proporción significativamente menor de Firmicutes a Bacteroidetes, el filo más abundante en el intestino humano39 que se ha descrito previamente como desequilibrada en otros trastornos37,38,40. Dado que estos estudios sugieren que la microbiota podría controlar el eje Th/Treg fuera del intestino, la estimulación inmunitaria por parte de bacterias específicas podría tener un efecto beneficioso sobre las enfermedades inflamatorias33. Así, se sabe que algunas cepas bacterianas podrían inducir la generación de células Treg (iTreg) a partir de precursores ingenuos23,41,42,43. Específicamente, la evidencia acumulada respalda el papel de las cepas comensales de Bifidobacterium y Clostridium spp. pertenecientes a los clusters IV y XIVa en la inducción de células Treg23,41,42,43.

El estudio tiene como objetivo evaluar la influencia de la microbiota fecal obtenida de pacientes con LES y controles sanos en la diferenciación in vitro de poblaciones Th y Treg, así como el posible efecto de enriquecer la microbiota intestinal con LES con bifidobacterias y cepas de Clostridia conocidas por ser inductoras de células Treg. . A continuación, analizamos la posible relación entre la disbiosis intestinal asociada al LES y la presencia de parámetros inmunitarios característicos de estos pacientes, como las poblaciones Treg/Th, los niveles de citoquinas, la actividad de la enfermedad y la producción de anti-dsDNA tanto patógenos como protectores naturales. Anticuerpos antifosforilcolina IgM.

Dada la disbiosis intestinal reportada recientemente en pacientes con LES39, nuestro objetivo fue evaluar la influencia de la microbiota fecal obtenida de pacientes con LES (LES-M) y controles sanos (HC-M) en la diferenciación in vitro de células T reguladoras (Treg), como así como poblaciones efectoras Th1 y Th17 de linfocitos T CD4+ vírgenes. Además, para estimar el efecto de enriquecer la microbiota intestinal con cepas capaces de aumentar el subconjunto Treg, se reemplazó el 5, 10 o 30 % de SLE-M con las mismas cantidades de Bifidobacterium bifidum LMG13195 (Bb), una cepa conocida por inducir expresión de Foxp323,41, o con una mezcla de dos cepas de Clostridia (Cl) con un supuesto efecto inductor de Treg (Ruminococcus obeum DSM25238 y Blautia coccoides DSM935)42,43. Por lo tanto, las DC derivadas de monocitos inmaduros se trataron durante 48 h con LPS, como control de maduración, o con las diferentes preparaciones bacterianas y luego se usaron para cebar linfocitos T CD4+CD45RA+ vírgenes. Después de 12 días de cultivo en presencia de IL-2, se determinaron las poblaciones de Treg (CD4+CD25highCD127lowFoxp3+), Th17 y Th1 (células que expresan IFNγ e IL-17, respectivamente) mediante citometría de flujo en linfocitos CD4+.

Como era de esperar, la estimulación y expansión con IL-2 indujo la expresión de IL-2Rα (CD25) en la mayoría de los linfocitos CD4+ (Fig. 1A), sin embargo, la cantidad de células que presentaron niveles elevados de CD25 (CD25high) mostró diferencias entre los tratamientos (Fig. 1B). Específicamente, los cultivos SLE-M tendieron a generar más células CD25 altas que HC-M, mientras que los niveles más bajos de esta población se obtuvieron después de la estimulación con la cepa Bb. De hecho, el efecto regulador al alza de SLE-M en la expresión de CD25 se revirtió después de la suplementación con Bb. En cuanto a las células Treg (CD4+CD25high CD127lowFoxp3+), no se observaron diferencias significativas entre la estimulación con HC-M o SLE-M. Sin embargo, la proporción de células Foxp3+ incluidas en la población CD25alta fue menor en cultivos derivados de SLE- que en HC-M (Fig. 1C), lo que sugiere que parte de las células CD25altas generadas en presencia de SLE-M eran linfocitos activados en lugar de HC-M. que las células Treg. Inesperadamente, aunque Bb incrementó notablemente las células Foxp3+, la suplementación de SLE-M con esta cepa no aumentó la generación de células Foxp3+ dentro del subconjunto alto de CD25.

Se cocultivaron linfocitos CD4+CD45RA+ naïve durante 12 días con DC previamente maduradas con LPS (control de maduración), microbiota fecal aislada de controles sanos (HC-M) o pacientes con LES (SLE-M) así como con Bifidobacterium bifidum LMG13195 ( Bb), cepas de Clostridia (Cl) o SLE-M que contienen 5, 10 o 30% de Bb o Cl. Se recuperaron células T CD4+ cultivadas, se tiñeron para marcadores Treg, IL-17 e IFNγ y se analizaron mediante citometría de flujo. (A) Estrategia de activación secuencial utilizada para identificar células Treg (CD4+CD25highCD127lowFoxp3+). Las células positivas para cada marcador se determinaron utilizando la fluorescencia de las células marcadas con el MAb irrelevante conjugado de isotipo correspondiente correspondiente como control negativo. Las células T CD4+ que mostraban la mayor expresión de CD25 se identificaron como CD4+CD25high. Luego, se analizó la población de CD25 alto para determinar la proporción de células que expresan Foxp3 (Foxp3+ dentro de CD25 alto) así como la cantidad de células Treg (CD25 alto CD127 bajo Foxp3+). Los gráficos de densidad corresponden a un experimento representativo. Análisis de (B) población alta de CD25, (C) células Foxp3+ dentro de la población alta de CD25 y (C) expresión de IL-17/IFNγ. Las barras representan la media y SEM de siete experimentos independientes realizados con diferentes donantes de sangre. Las diferencias estadísticas entre SLE-M y los diferentes tratamientos se evaluaron mediante la prueba de Wilcoxon para datos apareados. * p < 0,1; ** p < 0,05.

Finalmente, aunque no se detectaron diferencias significativas en la expresión de IL-17 o IFNγ entre células tratadas con ambas microbiotas fecales, la relación IL-17/IFNγ fue significativamente mayor en cultivos SLE- que en HC-M, mientras que la relación más baja fue inducida por DC acondicionados con Cl. Además, la suplementación con SLE-M con Cl, pero no con Bb, indujo una reducción significativa dependiente de la dosis del equilibrio IL-17/IFNγ (Fig. 1D). Por lo tanto, la estimulación in vitro de células T CD4+ vírgenes con SLE-M parece promover la activación de linfocitos y la diferenciación Th17 en mayor medida que el tratamiento con HC-M, lo que respalda las alteraciones Th17/Treg en SLE. Además, el enriquecimiento de la microbiota del LES con Bb puede prevenir la activación de los linfocitos, mientras que la suplementación con Cl restaura el equilibrio Th17/Th1.

Para saber si las respuestas Treg/Th provocadas in vitro por SLE-M podrían reflejar las características inmunitarias de los pacientes con LES, analizamos la expresión de Foxp3, CD25, CD127, IL-17 e IFNγ en linfocitos CD4+ de sangre periférica fresca, así como en suero. niveles de una batería de citocinas en 37 pacientes con LES y 36 con HC (tabla 1). Además, dado que 40 de estos individuos (20 LES y 20 HC) habían sido previamente incluidos en un estudio metagenómico de la microbiota fecal39 (tabla 2), determinamos la posible relación entre estos parámetros inmunes y la disbiosis intestinal asociada al LES.

Los resultados mostraron una mayor frecuencia de células Th17 en pacientes con LES en comparación con HC, especialmente en aquellos que presentaban anticuerpos anti-dsDNA, mientras que no se observaron diferencias significativas en el subconjunto Th1 (Fig. 2A). Además, las células Foxp3+ IL-17+ doblemente positivas estaban significativamente aumentadas en pacientes con LES en comparación con HC, observándose de nuevo los niveles más altos de dichas células en aquellos pacientes que presentaban anticuerpos anti-dsDNA (fig. 2B). No se detectaron diferencias significativas en el porcentaje de células Treg (CD4+ CD25high CD127lowFoxp3+), lo que sugiere que un proceso de transdiferenciación Treg-Th17 podría estar implicado en el desarrollo de células Foxp3+ sin actividad reguladora en pacientes con LES.

Se analizó la expresión de Foxp3, CD25, CD127, IL-17 e IFNγ en linfocitos CD4+ de sangre periférica fresca de pacientes con LES y HC. (A) Los diagramas de puntos muestran células positivas para la expresión de IL-17 o IFNγ, determinadas atendiendo a la fluorescencia de las células marcadas con el MAb irrelevante conjugado del isotipo correspondiente como control negativo. Los gráficos de dispersión representan el porcentaje de células CD4+ IL-17+ (Th17) e IFNγ+ (Th1) en pacientes con HC y LES que presentan (pos) o no (neg) anticuerpos anti-dsDNA (aDNA). Las barras horizontales muestran la mediana. (B) Las células Treg se identificaron secuencialmente como células CD4+CD25highCD127lowFoxp3+. Los gráficos de dispersión representan la cantidad de células Treg, Foxp3+ IL-17+ y Foxp3+ IFNγ+ en pacientes con HC y LES en función de su estado anti-dsDNA, y las barras horizontales muestran la mediana. Las diferencias estadísticas entre los grupos se evaluaron mediante la prueba de Kruskal-Wallis y se realizó la prueba posterior de Dunn para determinar qué pares de grupos tenían medias diferentes. ** p < 0,01; *** p < 0,001.

Por otro lado, el análisis de la microbiota fecal en el grupo HC reveló una correlación negativa entre la frecuencia de Firmicutes y el tamaño del subconjunto Th17, más notablemente en las células Foxp3+ IL-17+, mientras que ocurrió lo contrario con Bacteroidetes (Tabla 3 ); todas estas correlaciones se confirmaron mediante análisis de regresión lineal multivariante ajustados por peso, IMC y lípidos en sangre (*p < 0,05, R2 > 0,6). Sin embargo, tales asociaciones estaban completamente ausentes en los pacientes, de acuerdo con nuestra reducción descrita previamente de la relación Firmicutes/Bacteroidetes en LES.

En cuanto a los niveles séricos de citoquinas, los pacientes con LES presentaron mayores cantidades de IL-1β, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-17A, IFNα, TNFα, GM-CSF, BLyS y leptina que la HC, mientras que el IFNγ mostró una clara tendencia a la reducción (fig. 3A). Curiosamente, ninguna de las citoquinas aumentadas o sin cambios en el LES mostró asociaciones significativas con Firmicutes o Bacteroidetes, sin embargo, los niveles de IFNγ se correlacionaron negativamente con Bacteroidetes y positivamente con Firmicutes y la relación Firmicutes/Bacteroidetes en pacientes (Fig. 3B). Estas asociaciones no se detectaron en HC.

(A) La caja y los bigotes representan la mediana y el rango intercuartílico de las cantidades circulantes de citocinas en pacientes con LES en comparación con los controles. Las diferencias entre ambos grupos se evaluaron mediante la prueba no paramétrica U de Mann-Whitney. (B) Las correlaciones entre los niveles séricos de IFNγ y la frecuencia de Firmicutes, Bacteroidetes o la relación Firmicutes a Bacteroidetes (F/B) en pacientes con LES se evaluaron mediante la prueba de Spearman.

Como informamos anteriormente39, la proporción de Synergistetes fecales no mostró diferencias significativas entre pacientes con LES y controles sanos. Sin embargo, encontramos una tendencia de correlación negativa entre este grupo bacteriano y el título de anticuerpos anti-dsDNA (r = −0,386, p = 0,084), no detectada con ningún otro de los grupos microbianos analizados previamente. Asimismo, los niveles séricos de IL-6 se asociaron negativamente con la cantidad de Synergistetes en pacientes con LES (r = −0,738, p < 0,001), lo que sugiere una posible relación entre este grupo bacteriano y la actividad de la enfermedad o la producción de anticuerpos. Por tanto, con el objetivo de ampliar el conocimiento sobre el posible papel que juegan los sinergistetes intestinales en el desarrollo de las respuestas inmunes humorales, cuantificamos los niveles séricos de IgM anti-PC, anticuerpos protectores naturales e IgG anti-PC (sin este efecto), así como IgM e IgG circulantes totales. No se detectaron diferencias significativas en los anticuerpos anti-PC (IgM e IgG) e IgM total entre pacientes y controles, pero la cantidad de IgG total se incrementó en los pacientes en comparación con los controles (p = 0,027). Curiosamente, el título de anti-dsDNA se correlacionó negativamente con ambos isotipos de anticuerpos anti-PC (IgM: r = −0,508, p = 0,019; IgG: r = −0,460, p = 0,036) y con IgM total (r = −0,501, p = 0,021), pero no los niveles de IgG (r = 0,065, p = 0,780), lo que sugiere un efecto perjudicial de la actividad de la enfermedad de LES sobre los anticuerpos IgM protectores naturales.

Por otro lado, Synergistetes mostró una correlación positiva con la IgM total y anti-PC en pacientes con LES y con la relación IgM/IgG total y anti-PC en pacientes y controles (Tabla 4). Curiosamente, los niveles séricos de IL-6 en pacientes mostraron asociaciones opuestas. Todos estos resultados sugieren que los Synergistetes intestinales pueden promover el desarrollo de anticuerpos IgM naturales protectores, un efecto particularmente relevante en pacientes con LES ya que los niveles elevados de anti-dsDNA y/o IL-6 podrían regular a la baja este grupo bacteriano.

Finalmente, cabe destacar que Synergistetes correlacionó negativamente con Bacteroidetes (r = −0,486, p = 0,022) y positivamente con el cociente Firmicutes/Bacteroidetes (r = 0,443, p = 0,039) en controles, pero no en pacientes con LES (r = 0,075). , p = 0,745 y r = −0,136, p = 0,556, respectivamente), lo que respalda el papel de estos grupos bacterianos en el LES.

La disbiosis intestinal se ha asociado con varias enfermedades inmunomediadas, incluido el LES39 y otras afecciones autoinmunes32,33,34,35,36,37,38, lo que indica un posible papel del microbioma en el equilibrio entre las respuestas inflamatorias y reguladoras, ya sea en el intestinal o sistémicamente. Por lo tanto, comprender cómo la microbiota intestinal da forma a las respuestas inmunitarias parece ser fundamental para la salud humana, en particular en los trastornos inflamatorios crónicos como las enfermedades autoinmunes. Sin embargo, hasta donde sabemos, este es el primer estudio que evalúa el efecto de la microbiota intestinal aislada de muestras de heces con LES en la inducción de respuestas de células T reguladoras o efectoras.

Nuestros hallazgos revelaron que las diferencias en la composición de la microbiota fecal entre pacientes con LES y HC provocaron diferentes respuestas inmunes in vitro. Específicamente, las CD estimuladas con SLE-M promovieron la diferenciación Th17 de los linfocitos T CD4+ vírgenes en mayor medida que las CD condicionadas con HC-M. No se detectaron diferencias en la generación de células Treg, pero la población aumentada de CD25 obtenida con el tratamiento con SLE-M tendió a incluir una menor proporción de células Foxp3+, lo que respalda su estado activado en lugar de regulador. Por lo tanto, la microbiota intestinal alterada por LES podría mejorar la activación de los linfocitos y la diferenciación Th17, manteniendo así la inflamación preexistente.

Estos hallazgos están en consonancia con los resultados de los análisis ex vivo, ya que la frecuencia de células Th17 se incrementó en sangre periférica fresca de pacientes con LES en comparación con HC, especialmente en aquellos que presentaban anticuerpos anti-dsDNA, mientras que no se observaron diferencias en las células Treg. . Curiosamente, los pacientes con LES exhibieron una mayor proporción de células Foxp3+ productoras de IL-17, lo que sugiere un posible proceso de transdiferenciación Treg-Th17 que podría ser responsable de la actividad reguladora reducida de las células Treg reportada en pacientes con LES18. De manera similar, se ha encontrado una mayor prevalencia de linfocitos CD4+ de expresión doble de IL-17 y Foxp3 circulantes, junto con una capacidad supresora de Treg reducida, en pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal44. Cabe destacar la elevada frecuencia de células Treg presentes en el intestino en comparación con otros órganos45, pero tienen una mayor plasticidad Treg/Th que podría estar influenciada por mediadores inflamatorios, cepas bacterianas específicas y otros factores microambientales46. En línea con esto, los análisis de microbiota fecal revelaron una fuerte correlación negativa entre el tamaño de IL-17+ Foxp3+, y en menor medida Th17, las poblaciones y la frecuencia de Firmicutes en controles sanos, lo que sugiere que podrían contrarrestar la diferenciación Th17. Por otro lado, los niveles séricos de IFNγ, la citocina Th1 prototípica y ligeramente reducida en LES, se correlacionaron directamente en los pacientes con la cantidad de Firmicutes y con la relación Firmicutes/Bacteroidetes, siendo este desequilibrio la principal característica de la disbiosis en LES e independiente de la enfermedad. duración, estilo de vida y factores relacionados con la dieta39. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que las cepas bacterianas pertenecientes al filo Firmicutes podrían estar involucradas en la generación y/o mantenimiento de células Treg funcionales en el intestino, evitando la transdiferenciación en células efectoras Th17 en condiciones fisiológicas, mientras que una proporción disminuida de estas bacterias en situaciones patológicas puede promover el sesgo Th17 frente a Th1 y Treg y generar células IL-17+ Foxp3+. Por lo tanto, el enriquecimiento de la microbiota intestinal en bacterias inductoras de Treg podría ser un objetivo deseable para los pacientes con LES. Sin embargo, aunque la relación Firmicutes/Bacteroidetes representa la principal diferencia entre los controles sanos y los pacientes con LES, nuestro enfoque no pudo determinar los grupos bacterianos específicos implicados en la respuesta inmune Th17 observada asociada a la microbiota del LES, más aún teniendo en cuenta que Firmicutes phyla incluye bacterias inductoras tanto Th1747 como Treg23,41,42,43,44. Por lo tanto, la confirmación de tal hipótesis se beneficiaría de experimentos adicionales que utilicen ratones libres de gérmenes o procedimientos de trasplante de microbiota fecal en modelos animales.

Ciertos microorganismos comensales han demostrado una capacidad inductora de Treg y, por lo tanto, se han propuesto como posibles cepas probióticas apropiadas para la modulación de una respuesta inflamatoria excesiva para restaurar la homeostasis inmune en la mucosa intestinal. Por lo tanto, en este estudio realizamos análisis in vitro con el objetivo de determinar el posible efecto de enriquecer la microbiota intestinal del LES con cepas que se sabe que pueden diferenciar los linfocitos T vírgenes en células Treg. El filo Firmicutes contiene varias Clostridium spp., pertenecientes a los grupos IV y XIVa, conocidas por inducir células Treg23,41,42,43. De manera similar, también se ha demostrado que las bifidobacterias promueven la polarización de Treg y la reducción de Th17 in vivo utilizando modelos murinos de colitis48. Por lo tanto, utilizamos una mezcla de dos de estas cepas de Clostridia, así como una cepa de Bifidobacterium con capacidad in vitro previamente demostrada para generar células Treg funcionales23,24. Inesperadamente, ninguno de los dos pudo aumentar esta población, pero los resultados mostraron otros efectos beneficiosos, diferentes para cada tratamiento bacteriano. La suplementación de SLE-M con Clostridia indujo una reducción significativa dependiente de la dosis del equilibrio IL-17/IFNγ, restaurando así el sesgo Th1, mientras que el enriquecimiento con bifidobacterias evitó la sobreactivación de los linfocitos CD4+, detectada por la reducción de la expresión de CD25. Estos efectos, sin embargo, podrían ser la consecuencia de una supresión activa de las células Th efectoras. De hecho, la regulación a la baja observada de las células Th17 puede explicarse por una promoción preferencial de las células Treg por parte de las cepas de Clostridia, de acuerdo con los resultados obtenidos por Atarashi et al.43 utilizando ratones libres de gérmenes colonizados con diferentes fracciones de microbiota humana sana. Del mismo modo, la función supresora de las células Treg generadas con la cepa de Bifidobacterium utilizada aquí da como resultado una regulación a la baja de la expresión de CD25 en las células efectoras23. Por lo tanto, en vista de estos resultados y de la disbiosis del LES reportada previamente, parece razonable considerar el posible beneficio terapéutico de la suplementación con probióticos que contienen cepas inductoras de Treg para restaurar el equilibrio Treg/Th17/Th1 en pacientes con LES.

Otro resultado notable es el papel sugerido que juega Synergistetes, una bacteria intestinal poco conocida, en el LES. Este grupo bacteriano se correlacionó negativamente con Bacteroidetes y positivamente con la relación Firmicutes a Bacteroidetes en controles sanos, mientras que en pacientes con LES se mostró una fuerte correlación negativa con los niveles séricos de IL-6, una citocina proinflamatoria y promotora de Th17 aumentada en pacientes con LES. Además, la cantidad de Synergistetes tendía a reducirse cuando aumentaba el título de anticuerpos anti-dsDNA, característico del LES. Estos hallazgos nos llevaron a evaluar el posible papel de los Synegistetes intestinales en el desarrollo de respuestas inmunes humorales protectoras. Los anticuerpos IgM naturales contra bacterias comensales o neoantígenos de células apoptóticas están comúnmente presentes en la circulación humana desde el nacimiento y tienen funciones protectoras e inmunorreguladoras. Entre ellos, los anticuerpos IgM que reconocen la fosforilcolina (PC) son componentes valiosos del sistema inmunitario que se sabe que aumentan la fagocitosis de las células apoptóticas e inhiben las vías inflamatorias en la autoinmunidad y la aterosclerosis20,22,49. Sin embargo, la IgG anti-PC no parecía poseer estos efectos protectores. Los resultados en nuestra cohorte de LES revelaron que la proporción de Synergistetes se correlacionó positivamente con la proporción de IgM e IgM/IgG total y anti-PC en pacientes con LES, mientras que los niveles séricos de IL-6 exhibieron asociaciones opuestas. Estos datos sugieren un papel protector de los Synergistetes intestinales promoviendo la generación de anticuerpos IgM naturales, lo que podría verse obstaculizado en pacientes con LES, especialmente aquellos con niveles elevados de IL-6. Curiosamente, se ha informado que los anticuerpos IgM anti-PC pueden contrarrestar la regulación positiva de IL-6 in vitro e in vivo22, probablemente mediante la inhibición de las respuestas de MAPK a los agonistas de TLR, incluidos los complejos inmunes del lupus50, lo que explica las asociaciones opuestas de estos anticuerpos naturales con Sinergistetes e IL-6. Además, las células B1 y los anticuerpos anti-PC aumentan en ratones knockout para IL-6, mientras que ocurre lo contrario con las células B2 y los niveles de IgG51. De acuerdo con estos resultados, el título de anti-dsDNA se correlacionó negativamente con los niveles de anti-PC, lo que respalda un efecto nocivo de la actividad de la enfermedad sobre la cantidad de anticuerpos protectores naturales. De hecho, los niveles más altos de IgM anti-PC se han asociado con una menor actividad de la enfermedad del LES20. Lamentablemente, en nuestro estudio de la microbiota intestinal no se incluyeron pacientes activos para evitar interferencias con los tratamientos, por lo que no se detectaron asociaciones significativas entre la puntuación SLEDAI y Synergistetes o anticuerpos IgM anti-PC.

La implicación de Synergistetes en la promoción de anticuerpos naturales, y especialmente aquellos con un papel ateroprotector, podría tener relevancia clínica para los pacientes con LES y otras enfermedades autoinmunes, ya que suelen desarrollar aterosclerosis prematura y tienen un riesgo cardiovascular aumentado no explicado por factores clásicos . Se ha informado que niveles disminuidos de anticuerpos IgM anti-PC en pacientes con LES podrían predecir una enfermedad cardiovascular subclínica21. Además, los pacientes que han sufrido un evento cardiovascular presentan niveles significativamente más bajos de estos anticuerpos en comparación con el resto de pacientes21,49. De hecho, la terapia basada en la transferencia pasiva de anti-PC se ha utilizado para inhibir el desarrollo de la aterosclerosis52. Por lo tanto, la identificación de microorganismos intestinales capaces de expandir las respuestas humorales naturales a través de la promoción de anticuerpos IgM protectores, como pueden ser Synergistetes, podría ser una herramienta valiosa para diseñar intervenciones clínicas con el fin de mejorar tanto la actividad de la enfermedad como la prevención de complicaciones cardiovasculares. En este sentido, el análisis de Synergistetes fecales en pacientes con LES con y sin eventos cardiovasculares debería ser de interés.

En resumen, nuestros cultivos in vitro con microbiota fecal aislada de pacientes con LES sugirieron que las respuestas inmunitarias contra las bacterias intestinales podrían estar involucradas en la sobreactivación de los linfocitos, así como en la transdiferenciación de Treg-Th17 observada en pacientes con LES, con Firmicutes reducido. a relación Bacteroidetes probablemente tenga un papel en este proceso. Las respuestas inmunitarias alteradas asociadas con la disbiosis intestinal podrían restablecerse, al menos en parte, mediante la suplementación con cepas bacterianas beneficiosas capaces de inducir respuestas supresoras. Además, nuestros resultados revelaron un posible papel de los sinergistetes intestinales en el desarrollo de anticuerpos IgM anti-PC protectores naturales. Esto podría ser de especial relevancia en pacientes con niveles elevados de IL-6 y/o anti-dsDNA, ya que presentan baja frecuencia de estas bacterias.

La aprobación ética para este estudio se obtuvo del Comité de Bioética del CSIC (Consejo Superior de Investigaciones Científicas) y del Comité Regional de Ética para la Investigación Clínica (Servicio de Salud del Principado de Asturias), según la Declaración de Helsinki. Todos los métodos se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas aprobadas y se obtuvo el consentimiento informado por escrito firmado de todos los participantes antes de participar en el estudio.

Se obtuvieron células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) a partir de preparaciones estándar de capa leucocítica de 7 donantes de sangre sanos (Centro de Transfusión de Sangre de Asturias, Oviedo, España) mediante centrifugación en gradientes de Ficoll-Hypaque (Lymphoprep, Nycomed, Oslo, Noruega). Se aislaron monocitos (CD14+ ≥ 95 %) de PBMC obtenidas previamente mediante selección negativa utilizando el kit de enriquecimiento de monocitos humanos (EasySep, Stem Cell Technologies, Canadá).

Se obtuvieron DC inmaduras a partir de monocitos aislados mediante procedimientos estándar. Así, los monocitos se cultivaron en placas de 24 pocillos a 5 × 105 células/ml durante 7 días a 37 °C y 5 % de CO2 en medio RPMI completo (RPMIc) [RPMI 1640 que contenía 2 mML-glutamina y 25 mM Hepes (Bio Whitaker, Verviers, Bélgica), suplementado con suero fetal de ternero (FCS) inactivado por calor al 10 % y los antibióticos estreptomicina y ampicilina a 100 mg/ml] en presencia de IL-4 humana recombinante (rh) (35 ng/ml) y rhGM -CSF (70 ng/ml) (R&D Systems, Abingdon, Reino Unido). En los días 2 y 5, se extrajeron 0,5 ml del medio sin perturbar los grupos de DC en desarrollo y se añadieron a los pocillos 0,5 ml de medio recién preparado que contenía GM-CSF e IL-4, restaurando el volumen final en cada pocillo. a 1 ml. El día 7, las CD inmaduras se recuperaron, lavaron y resuspendieron en medio RPMIc a 5 × 105 células/ml para su posterior maduración.

Las DC derivadas de monocitos inmaduros se cultivaron en medio RPMIc con 1 mg/ml de LPS de E. coli 0111:B4 (Sigma, St. Louis, MO), como control positivo de maduración, o con diferentes preparaciones bacterianas a una DC:bacteria proporción de 1:10. Con este fin, se preparó y usó en DC una microbiota fecal (M) agrupada aislada de cuatro controles sanos (HC-M) o cinco pacientes con LES (SLE-M), que previamente se demostró que era representativa de ambas condiciones por estudios metagenómicos39. culturas Además, SLE-M se enriquecieron con diferentes proporciones de Bifidobacterium bifidum LMG13195 (Bb), una cepa conocida por inducir la expresión de Foxp323,41, o con una mezcla de dos cepas de Clostridia (Cl: Ruminococcus obeum DSM25238 y Blautia coccoides DSM935, proporción 1: 1), que tienen un supuesto efecto inductor de Treg42,43. Por lo tanto, 5, 10 o 15 % de SLE-M se reemplazó con las mismas proporciones de Bb o Cl y se usó para la estimulación de las CD. Como controles se realizaron cultivos con preparaciones bacterianas Bb y Cl. Después de 48 horas, se recolectaron las CD de los 11 tratamientos diferentes, se analizó el fenotipo maduro y se usó para estimular las células T CD4+ vírgenes.

Los linfocitos T CD4+ se aislaron de PBMC mediante selección negativa utilizando el kit de enriquecimiento de linfocitos T CD4+ humanos (EasySep), siguiendo las instrucciones del fabricante, y luego los linfocitos T CD45RA+ vírgenes se separaron después del agotamiento de los linfocitos CD45RO+ (Miltenyi Biotec, Alemania). Las DC derivadas de monocitos maduradas con LPS o con las diferentes preparaciones bacterianas se cocultivaron con células T CD4+ CD45RA+ purificadas en placas de 48 pocillos en una relación DC:células T de 1:10. En los días 5 y 8, las células incubadas con todos los tratamientos se expandieron con IL-2 (30 U). Después de 12 días, las células se recolectaron y lavaron dos veces antes del análisis del fenotipo Treg/Th17/Th1 por citometría de flujo.

Bifidobacterium bifidum LMG13195 se cultivó en caldo MRS (Difco, Detroit, MI) suplementado con L-cisteína al 0,05 % (p/v) (Sigma). Ruminococcus obeum DSM25238 y Blautia coccoides DSM935 se cultivaron en una combinación de Caldo Clostridial Reforzado (Merck, Darmstadt, Alemania) e Infusión Cerebro-Corazón (Difco), complementado con FCS inactivado por calor al 5% (v/v) (LabClinics, Barcelona, España). Los cultivos se cultivaron a 37 °C en una cámara anaeróbica MG500 (Don Whitley Scientific, West Yorkshire, Reino Unido) con una atmósfera de 10 % (v/v) de H2, 10 % de CO2 y 80 % de N2. Los cultivos se recogieron por centrifugación, se lavaron tres veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se resuspendieron en el mismo tampón hasta una concentración de 108 bacterias/ml. Las bacterias se contaron utilizando una cámara de recuento de células Thoma (Marienfeld Superior, Alemania). Las células bacterianas fueron eliminadas exponiéndolas a tres ciclos consecutivos de 30 minutos bajo radiación en una cámara UV (15 W, Selecta, Barcelona, ​​España). El recuento en placa se realizó después del tratamiento con UV para corroborar la ausencia de bacterias capaces de recuperarse en el medio adecuado. Las suspensiones bacterianas eliminadas por UV se distribuyeron en alícuotas y se almacenaron a -80 °C hasta su uso. La identidad de las cepas se confirmó secuenciando las regiones variables V1 y V2 del gen 16 S rRNA utilizando los cebadores plb16 (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) y mlb16 (5′-GGCTGCTGGCACGTAGTTAG-3′)53.

Una porción de muestra de heces de 4 controles sanos y 5 pacientes con LES, previamente utilizada en un estudio metagenómico39, se sometió a centrifugación en gradiente de densidad para separar la microbiota del resto de la materia fecal, según el método de Courtois et al.54 . Las heces se homogeneizaron en NaCl estéril al 0,9% (1:9; p/v) durante 1 min en un homogeneizador (Stomacher Lab Blender 400, WVR, Barcelona, ​​España). Se preparó una solución de Nycodenz® al 80 % (p/v) (PROGEN Biotechnik GmbH, Heidelberg, DE) en agua ultrapura y se esterilizó a 121 °C durante 15 min. Se colocó un volumen de 10,5 ml de las muestras fecales homogeneizadas sobre 3,5 ml de la solución de Nycodenz® y se centrifugó a 10.000 g durante 40 min a 4 °C. La fase superior, que contenía los detritos solubles, se descartó y las capas correspondientes a la microbiota se mantuvieron en hielo durante 5 min, para permitir la precipitación de los detritos no solubles, se lavaron dos veces en PBS y se almacenaron en el mismo tampón en alícuotas de 1 ml de 108 microorganismos/ml a −80 °C. La microbiota inactivada con UV se obtuvo como se describe en la sección anterior.

Treinta y siete pacientes con LES que cumplían al menos cuatro criterios revisados ​​del American College of Rheumatology (ACR) para la clasificación de LES55 fueron seleccionados del Registro Asturiano de Lupus actualizado56,57. La información sobre las características clínicas durante el curso de la enfermedad se obtuvo mediante la revisión de las historias clínicas (tabla 1). Treinta y seis donantes de sangre sanos emparejados por sexo y edad se utilizaron como controles (edad media ± DE: 42,56 años ± 11,39). En el momento de la toma de muestras, título anti-dsDNA, índice de actividad de la enfermedad del LES (SLEDAI) y/o peso, IMC (índice de masa corporal) y lípidos en sangre [Triglicéridos, HDL (lipoproteínas de alta densidad), LDL (lipoproteínas de baja densidad) y colesterol total] y se formularon preguntas precisas a los pacientes sobre el tratamiento recibido durante los 6 meses anteriores.

El análisis metagenómico de la microbiota fecal se realizó en 20 pacientes con LES no activo sin tratamiento antibiótico o inmunosupresor en los últimos 6 meses y 20 controles sanos de la misma edad como se describió previamente39. La extracción de ADN fecal, la secuenciación de amplificación de 16 S rRNA de amplicones basados ​​en el gen 16 S rRNA y el análisis de microbiota basado en secuencias se informaron en otros lugares39. Las secuencias sin procesar informadas en este artículo están depositadas en el archivo de lectura breve (SRA) del NCBI (número de registro del estudio: SRP028162).

Se realizaron estudios fenotípicos de células cultivadas y muestras de sangre después de la tinción con el anticuerpo monoclonal (mAb) apropiado. La maduración de las CD cultivadas se verificó después de teñirlas durante 30 min a 4 °C con isotiocianato de fluoresceína anti -CD86 (FITC), -CD80 ficoeritrina (PE), -HLA-DR PE-Cy5, -CD1a FITC mAb, o con el isotipo correspondiente mAb irrelevante conjugado emparejado como control negativo (todos los mAb fueron suministrados por Pharmingen). Para determinar el fenotipo Treg/Th17/Th1 tanto en células cultivadas como en muestras de sangre [lisadas previamente con 2 ml de solución de lisis BD (BD Biosciences, San Diego, CA) durante 5 minutos y lavadas dos veces con PBS], los linfocitos CD4+ primero se tiñeron extracelularmente con aloficocianina-Cy7 anti-CD4 (APC-Cy7), FITC anti-CD25 y mAb PE-Cy7 anti-CD127 o con el mAb irrelevante conjugado de isotipo correspondiente correspondiente (todos de eBiosciences, San Diego, CA). Luego, las células se fijaron, permeabilizaron y tiñeron intracelularmente con anti-FOXP3 PE, IFNγ PerCP-Cy5.5 e IL-17 A APC (Foxp3/conjunto de tampones de tinción de factor de transcripción; eBiosciences) o con el mAb irrelevante conjugado de isotipo correspondiente. siguiendo las instrucciones del fabricante. Se adquirieron un mínimo de 10.000 linfocitos CD4+ en un citómetro de flujo (BD) FACSCanto II y se analizaron utilizando el software FlowJo (Tree Star Inc). La intensidad de fluorescencia específica se cuantificó como la intensidad de fluorescencia media (MFI) calculada restando el fondo de la tinción de control coincidente con el isotipo de la fluorescencia total.

Las muestras de suero de pacientes con LES y HC se recolectaron y mantuvieron a -80 °C hasta que se llevó a cabo la determinación de citoquinas. Las cantidades de IL-1β, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-17 A, IFNα, VEGF y GM-CSF se analizaron mediante Cytometric Bead Arrays Flex Set utilizando un FACS Canto II citómetro de flujo (BD Biosciences). Para IL-1β, IL-6, IL-10 e IL-12p70, se necesitaba un conjunto flexible de sensibilidad mejorada. Se utilizaron kits ELISA para la cuantificación de TNFα, leptina, resistina (kit Mini EDK, PeproTech), BLyS (Human BAFF Instant ELISA, eBioscience) e IFNγ (kit OptEIA, BD) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los límites inferiores de detección fueron 48,4 fg/ml para IL-1β, 1,4 pg/ml para IL-4, 68,4 fg/ml para IL-6, 1,2 pg/ml para IL-8, 13,7 fg/ml para IL-10 , 12,6 fg/ml para IL-12p70, 0,3 pg/ml para IL-17 A, 1,25 pg/ml para IFNα, 4,5 pg/ml para VEGF, 0,2 pg/ml para GM-CSF, 3,9 pg/ml para TNFα, 63 pg/ml para leptina, 24 pg/ml para resistina, 130 pg/ml para BLyS y 0,58 pg/ml para IFNγ.

Los anticuerpos IgG e IgM contra la fosforilcolina (anti-PC) se cuantificaron en muestras de suero de pacientes y controles mediante una prueba ELISA interna, de la siguiente manera. Los pocillos de microtitulación (Maxisorp, Nunc) se recubrieron durante la noche con fosforilcolina conjugada con albúmina de suero bovino (PC-BSA) (Biosearch Technologies, Petaluma) y se bloquearon con PBS BSA al 2 % durante 2 horas a 37 °C. Se usó un conjunto de sueros de controles sanos como estándar anti-PC Ab. Las muestras de suero y el estándar anti-PC se diluyeron en Tris Buffered Saline (TBS) y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente (RT). Después de lavar con TBS/Tween 20 (0,05%), los pocillos se incubaron durante 2 horas a TA con IgG o IgM antihumana conjugada con fosfatasa alcalina (Immunostep, Salamanca, España). Finalmente, las placas se lavaron dos veces y se revelaron usando p-nitrofenilfosfato como sustrato. La absorbancia se determinó a una longitud de onda de 405 nm. Se calcularon las cantidades de unidades arbitrarias de suero anti-PC para cada muestra de acuerdo con las curvas estándar. De manera similar, se cuantificaron IgG o IgM totales mediante técnicas ELISA convencionales.

Se utilizó la prueba de Kolmogorov-Smirnov para evaluar la distribución normal de los datos. Los datos de los experimentos in vitro se representaron mediante la media ± SEM y las diferencias entre las condiciones de cultivo se evaluaron mediante la prueba de Wilcoxon pareada. Los niveles séricos de citoquinas en pacientes con LES y controles sanos se expresaron como el valor medio (rango intercuartílico) y se utilizó la prueba no paramétrica U de Mann-Whitney para determinar las diferencias entre ambos grupos. Los porcentajes de células Treg/Th1/Th17 se compararon utilizando la prueba de Kruskal-Wallis; cuando se obtuvo una prueba significativa, se realizaron pruebas post hoc de Dunn para determinar diferencias estadísticas en pares de grupos. Las asociaciones de frecuencias de grupos microbianos fecales con subconjuntos de células T, niveles séricos de citocinas y autoanticuerpos se examinaron mediante la prueba de correlación de rangos de Spearman y se confirmaron mediante análisis de regresión lineal multivariable ajustados por peso, IMC y lípidos en sangre (triglicéridos, HDL, LDL y colesterol total). Se utilizó el software Prism 5 (GraphPad Software, EE. UU.) y el paquete de software estadístico SPSS 22 (SPSS Inc.) para todas las determinaciones, y se consideró significativo un valor de p < 0,05.

Cómo citar este artículo: López, P. et al. Las respuestas Th17 y los anticuerpos IgM naturales están relacionados con la composición de la microbiota intestinal en pacientes con lupus eritematoso sistémico. ciencia Rep. 6, 24072; doi: 10.1038/srep24072 (2016).

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This work was supported by European Union FEDER funds, Fondo de Investigación Sanitaria (PI12/00523), Spanish Plan Nacional de I+D (AGL2010-14952 and AGL2013-44039-R) and Fundación para el Fomento en Asturias de la Investigación Científica Aplicada y la Tecnología (EQUIP09-19). J.R.-C. is a recipient of a FPU grant from the Spanish Ministerio de Educación, Cultura y Deporte. B.J. and A.H. are recipients of a Ramón y Cajal postdoctoral contract and a FPI grant, respectively, both from the Spanish Ministerio deEconomía y Competitividad. We thank SLE patients and ALAS (Asociación Lúpicos de Asturias) for their continuous encouragement.

Departamento de Biología Funcional, Área de Inmunología, Facultad de Medicina, Universidad de Oviedo, Oviedo, Asturias, España

Patricia Lopez, Banes of Peace, Javier Rodriguez-Carrio & Ana Suarez

Department of Microbiology and Biochemistry of Dairy Products, Instituto de Productos Lácteos de Asturias (IPLA), Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC), Villaviciosa, Asturias, Spain

Banesa de la Paz, Heavy Spider, Borja Sanchez & Abelardo Margolles

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PL participó en la realización del estudio, la recolección de muestras, la revisión de las manifestaciones clínicas, la actividad de la enfermedad y la terapia de los pacientes, los procedimientos experimentales, el análisis/interpretación de datos y la preparación del manuscrito. BP y JR-C. realizó algunos procedimientos experimentales y análisis de datos. BS, AH y AM participaron en estudios de diseño, experimentos y análisis relacionados con la microbiota. AS contribuyó al diseño/realización del estudio, interpretación de datos y preparación del manuscrito.

Correspondencia a Abelardo Margolles.

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

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Reimpresiones y permisos

Lopez , P. , de Peace , B. , Rodriguez-Carrio , J. et al. Las respuestas Th17 y los anticuerpos IgM naturales están relacionados con la composición de la microbiota intestinal en pacientes con lupus eritematoso sistémico. Informe científico 6, 24072 (2016). https://doi.org/10.1038/srep24072

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Recibido: 14 Septiembre 2015

Aceptado: 18 de marzo de 2016

Publicado: 05 abril 2016

DOI: https://doi.org/10.1038/srep24072

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