Los datos de rendimiento de la prueba demuestran la utilidad de un reactivo de prueba cutánea DIVA para ganado (DST

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 12052 (2022) Citar este artículo

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Bacillus Calmette-Guérin (BCG), una cepa atenuada de Mycobacterium bovis (M. bovis), es la principal vacuna candidata para el control de la tuberculosis (TB) bovina en el ganado. Sin embargo, la vacunación con BCG sensibiliza al ganado bovino a la tuberculina bovina, comprometiendo así el uso de las actuales pruebas de vigilancia de la TB bovina. Para solucionar este problema, hemos desarrollado una prueba cutánea de diagnóstico que no se ve comprometida por la vacunación con BCG y es capaz de detectar animales vacunados con BCG que posteriormente desarrollan TB bovina tras la exposición a M. bovis. Sobre la base de trabajos anteriores que utilizaron reactivos de cóctel de proteínas formulados 'en casa', aquí presentamos datos de rendimiento de prueba para una sola proteína de fusión (DST-F) que contiene los antígenos micobacterianos ESAT-6, CFP-10 y Rv3615c formulados como un 'listo para usar'. reactivo de un fabricante comercial. Nuestros resultados demuestran que, a diferencia de los reactivos de tuberculina, una prueba cutánea de diagnóstico que usa DST-F mantuvo una alta especificidad en animales vacunados con BCG. Además, la prueba cutánea DST-F demostró una alta sensibilidad relativa para identificar animales infectados con M. bovis, incluidos aquellos en los que la vacunación con BCG no logró prevenir la patología de TB bovina después de la exposición experimental a M. bovis. El DST-F se encuentra actualmente en pruebas de campo en Gran Bretaña para respaldar su licencia y comercialización.

La tuberculosis (TB) bovina es una enfermedad que afecta a importantes especies ganaderas en todo el mundo. Aunque la enfermedad es causada por patógenos del grupo de micobacterias Mycobacterium tuberculosis, en muchos países (incluido el Reino Unido) la TB bovina es causada casi exclusivamente por M. bovis. La TB bovina es una fuente importante de pérdidas económicas debido tanto a la reducción de la productividad como al costo de los programas de control, con una pérdida económica global estimada en alrededor de US$3 mil millones por año1. Además, la TB bovina tiene importantes consecuencias zoonóticas, particularmente en países de ingresos bajos a medianos donde no se puede garantizar la pasteurización de la leche del ganado2.

En el Reino Unido, como en muchos países de altos ingresos, se está empleando una estrategia de prueba y matanza que se basa en la prueba de tuberculina cervical comparativa intradérmica única (SICCT), con un ensayo de liberación de interferón-gamma que a veces se aplica como una prueba auxiliar para maximizar la detección de animales infectados. Sin embargo, esta estrategia de control tiene un alto costo, tanto desde el punto de vista financiero, donde se estima que combatir la TB bovina solo en Inglaterra le cuesta al contribuyente alrededor de £ 70 millones al año con costos adicionales de £ 50 millones para los ganaderos3, pero también éticamente donde alrededor de 38,000 cabezas de ganado fueron sacrificados en GB entre julio de 2020 y junio de 2021 para combatir la enfermedad. Por lo tanto, el desarrollo de una vacuna contra la TB bovina es una alta prioridad de investigación.

Hasta la fecha, la única vacuna disponible para la TB bovina es el bacilo Calmette-Guérin (BCG), una cepa atenuada de M. bovis, y los estudios de eficacia que evalúan el efecto de la vacunación con BCG contra la infección experimental por M. bovis en el ganado han demostrado resultados prometedores4,5 . Además, la eficacia de la vacunación con BCG también se ha demostrado en estudios de campo6,7,8,9. Sin embargo, aunque los estudios demuestran que la vacunación con BCG reduce la gravedad de la enfermedad de TB bovina, también destacan que no es totalmente protectora en todos los vacunados10,11,12,13,14,15. Por lo tanto, todavía se requieren pruebas de diagnóstico para detectar animales vacunados con BCG que desarrollan TB bovina después de la exposición a M. bovis. Desafortunadamente, la vacuna BCG sensibiliza al ganado a los reactivos de las pruebas cutáneas de diagnóstico actuales (es decir, derivados proteicos purificados de la tuberculina), lo que impide su uso en este entorno16. Por lo tanto, para garantizar la continuación de una estrategia de control basada en la prueba y el sacrificio en el contexto de la vacunación con BCG, los esfuerzos de investigación se han centrado en desarrollar una prueba cutánea de diagnóstico que: (i) no induzca reacciones de prueba cutánea falsamente positivas en animales vacunados con BCG; y (ii) es capaz de detectar animales vacunados con BCG que posteriormente desarrollan TB bovina tras la exposición a M. bovis. El desarrollo inicial de esta llamada 'prueba cutánea DIVA' (DIVA: Detecting Infected between Vaccinated Animals) se basó en la evaluación de cócteles de proteínas micobacterianas recombinantes17 y dio como resultado la priorización de las proteínas ESAT-6, CFP-10 y Rv3615c18, mientras que el perfeccionamiento exploró la uso de estos como un único reactivo de proteína de fusión formulado 'en casa'19. Para ampliar estos estudios, hemos trabajado en estrecha colaboración con un fabricante comercial para producir un reactivo de proteína de fusión de prueba cutánea DIVA (DST-F) 'listo para usar', y los datos de rendimiento de este reactivo se presentan aquí.

Para evaluar la capacidad de la DST-F para identificar ganado infectado, se realizaron una serie de estudios experimentales de infección por M. bovis (Tabla 1; estudios 1–3). El examen post mortem para patología de TB bovina y el cultivo de muestras de tejido post mortem confirmaron la infección por M. bovis en los 71 animales estudiados (datos no mostrados). En total, 68 de estos animales dieron positivo a la prueba DST-F (Tabla 2), que fue mayor que la observada para la prueba SICCT (62 pruebas positivas) y solo un poco menor que la observada para la prueba SIT (70 pruebas positivas) . Aunque esto proporcionó datos de rendimiento alentadores para la DST-F en animales infectados con M. bovis, el verdadero grupo objetivo de animales para esta prueba son los bovinos vacunados con BCG que no logran estar completamente protegidos contra el desarrollo de la TB bovina. Por lo tanto, para evaluar la capacidad de la DST-F para identificar ganado vacunado con BCG que mostró signos de TB bovina después de la exposición experimental a M. bovis, realizamos tres experimentos separados de vacuna/desafío (estudios 4–6). De nuevo, al final de cada experimento, todos los animales se sometieron a un examen post mortem detallado en el que se puntuaron los signos de patología de TB bovina y se recogieron muestras de ganglios linfáticos y tejido pulmonar para el cultivo de M. bovis. Los resultados de estas investigaciones se resumen en la Fig. 1. En los tres experimentos, el nivel de patología visible en el tejido de los ganglios linfáticos fue significativamente menor en el grupo de animales vacunados/infectados en comparación con el grupo de control solo infectado en ese experimento. De manera similar, en dos de los tres experimentos, la puntuación total de lesiones visibles también fue significativamente menor en este grupo de animales. Por tanto, los tres experimentos demostraron un efecto protector de la vacunación con BCG sobre la gravedad de la patología de la TB bovina tras la infección experimental con M. bovis. Sin embargo, estos resultados también indicaron que aunque la BCG limita la gravedad de la patología de la TB bovina, no evitó la infección por M. bovis per se, ya que M. bovis pudo cultivarse a partir de tejido post mortem de todos menos uno de los 73 vacunados con BCG/M. . bovis animales infectados (datos no mostrados). Por lo tanto, evaluamos la capacidad del reactivo DST-F para detectar los 72 vacunados con BCG confirmados por cultivo/M. animales infectados con bovis. De estos 72 animales, 65 dieron positivo al reactivo DST-F (Tabla 2), que fue mayor que el observado para la prueba SICCT (61 pruebas positivas) pero menor que el observado para la prueba SIT (72 pruebas positivas). Para los no vacunados/M. bovis de estos estudios, todos los animales de control infectados mostraron evidencia de infección por M. bovis y, con la excepción de un animal en el estudio 6, dieron positivo al reactivo DST-F. Todos los animales de estos grupos también dieron positivo en las pruebas SICCT y SIT.

Reducción de la patología visible de TB bovina en vacunados con BCG. Las puntuaciones de los ganglios linfáticos, los pulmones y la patología total para los vacunados con BCG/M. bovis infectados (Vac/Inf) y los no vacunados/M. controles infectados con bovis (Inf) del estudio 4 (A), estudio 5 (B) y estudio 6 (C). Cada símbolo representa un animal individual, mientras que las barras horizontales representan los valores medianos del grupo. *p < 0,05, **p < 0,01, prueba de Mann-Whitney.

Para evaluar el nivel de resultados falsos positivos inducidos por la DST-F, se realizaron pruebas cutáneas en tres grupos de animales no infectados (estudios 7 a 9) y los resultados se resumen en la Tabla 2. En los dos estudios con animales de control no infectados, no se observaron respuestas falsas positivas a los reactivos DST-F o tuberculina. De manera similar, no se observaron respuestas positivas falsas a la DST-F en los 20 terneros vacunados con BCG (estudio 9). En contraste, una alta proporción de los terneros vacunados con BCG que fueron probados con reactivos de tuberculina dieron respuestas positivas falsas, con 7/10 y 10/10 dando positivo a la prueba SICCT y SIT respectivamente.

Los datos de las pruebas cutáneas generados a partir de estos nueve estudios se combinaron y se resumen en la Tabla 3. La sensibilidad relativa de la DST-F para detectar animales infectados con M. bovis fue del 95 %, superior a la de la prueba SICCT (89 %). pero inferior al de la prueba SIT (99%). Sin embargo, ninguna de estas diferencias alcanzó significación estadística. La sensibilidad relativa de la DST-F en la detección de animales vacunados con BCG que mostraron signos de TB bovina después de la infección experimental con M. bovis fue ligeramente inferior al 90 %. Nuevamente, esto fue más alto que el de la prueba SICCT (85 %), pero significativamente (p < 0,05, prueba de McNemar) más bajo que el de la prueba SIT (100 %). Ninguna de las tres pruebas cutáneas indujo respuestas falsas positivas en animales de control no infectados, lo que resultó en estimaciones de especificidad del 100 %. De manera similar, no se observaron respuestas positivas falsas a la DST-F en animales vacunados con BCG, lo que resultó nuevamente en una estimación de especificidad del 100 %. Por el contrario, se observaron valores significativamente más bajos para las pruebas SICCT (p < 0,05, prueba de McNemar) y SIT (p < 0,01, prueba de McNemar) en este grupo de animales, con estimaciones de especificidad del 30% y 0% respectivamente.

Nuestro desarrollo inicial de un reactivo de prueba cutánea DIVA se basó en cócteles de proteínas micobacterianas recombinantes que eran inmunogénicas en ganado infectado con M. bovis pero que no inducían respuestas en animales sin tratamiento previo o vacunados con BCG17, y un cóctel que constaba de ESAT-6, CFP-10 y las proteínas Rv3615c se priorizaron para su evaluación en diferentes grupos de ganado. Los resultados de estos análisis demostraron una alta especificidad de este reactivo cuando se probó en animales vacunados con BCG o controles no infectados, al tiempo que mantuvo una sensibilidad relativa para la detección de infección similar a la de la prueba SICCT de tuberculina cuando se evaluó con interpretación estándar18. Sin embargo, desde el punto de vista de la fabricación, la producción de un solo reactivo de proteína de fusión tiene muchas ventajas sobre uno que consta de un cóctel de tres proteínas individuales. Por ejemplo, solo se requiere una única tanda de producción para la proteína de fusión, a diferencia de las tres tandas de producción separadas que se requieren para los componentes del cóctel. Además, en comparación con la producción del reactivo cóctel, la producción de una sola proteína de fusión reduciría en un tercio los datos de control de calidad asociados requeridos. Por último, no sería necesario disponer de un sistema para formular un cóctel de reactivos a partir de los tres componentes producidos individualmente. Los datos de prueba de concepto demostraron que una proteína de fusión de ESAT-6, CFP-10 y Rv3615c inducía la producción in vitro de IFN-γ utilizando células mononucleares de sangre periférica de ganado infectado con M. bovis, pero no de controles ingenuos o animales vacunados con BCG19. Además, esta proteína de fusión generó reacciones cutáneas positivas en los animales infectados con M. bovis, pero no en los controles ingenuos cuando se formuló 'internamente' como reactivo de prueba cutánea19. Para desarrollar aún más este reactivo en un producto comercial potencial, trabajamos con el fabricante (es decir, Lionex) para producir un reactivo de prueba cutánea DIVA de proteína de fusión (denominado DST-F) que podría usarse 'directamente de la botella' en de manera similar a los reactivos de tuberculina. Además, se desarrollaron protocolos de control de calidad y criterios de liberación de lotes (ver materiales y métodos) para garantizar la consistencia de lote a lote, teniendo en cuenta la posible ampliación a la fabricación comercial de acuerdo con los estándares de Buenas Prácticas de Manufactura. En total, los reactivos de la prueba cutánea DIVA basados en el cóctel y las formulaciones de proteínas de fusión se han probado "cara a cara" en 191 animales individuales (datos no publicados). El análisis estadístico que evaluó el resultado de la prueba de los dos reactivos demostró una concordancia observada del 94 % con un coeficiente kappa de Cohen de 0,885 (IC del 95 % de 0,819 a 0,951), lo que indica una "concordancia casi perfecta"20 entre los dos reactivos (datos no mostrados ). Por lo tanto, dadas las ventajas de fabricación de la proteína de fusión, se seleccionó el reactivo DST-F como el reactivo candidato para la prueba cutánea DIVA.

Como se resume en la Tabla 3, la sensibilidad relativa de la DST-F para identificar animales infectados con M. bovis experimentalmente confirmados fue del 95 % (IC del 95 % de 88 % a 98 %), que fue mayor que la de la prueba SICCT realizada en el laboratorio. mismo tiempo en estos animales. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que esta estimación de sensibilidad relativa se generó usando animales infectados experimentalmente y puede que no represente completamente el rendimiento de la prueba DST-F cuando se usa en ganado infectado de forma natural. De hecho, los datos publicados anteriormente para la formulación del cóctel de prueba cutánea DIVA demostraron una proporción significativamente menor de resultados positivos en la prueba en animales infectados de forma natural en comparación con animales infectados experimentalmente (78 y 100 % respectivamente; p < 0,05, prueba exacta de Fisher), aunque debe destacarse que la proporción de animales infectados de forma natural que dieron positivo en la prueba estándar SICCT también fue de alrededor del 76 %18. Además, nuestros datos iniciales de prueba de concepto para la formulación de proteína de fusión 'interna' demostraron un resultado similar, con un 76 % de animales infectados naturalmente (16 de 21) en comparación con el 100 % de animales infectados experimentalmente (6 de 6) dando un resultado positivo en la prueba cutánea (datos no mostrados). Por lo tanto, uno de los objetivos de nuestra investigación actual es evaluar aún más el rendimiento de la DST-F en un mayor número de bovinos infectados de forma natural para proporcionar cálculos de precisión estadísticamente sólidos de la sensibilidad de la prueba DST-F en un escenario realista para respaldar futuras pruebas DST-F. ejercicios de validación.

Numerosos estudios de vacunación/desafío durante los últimos 25 años demuestran que la vacunación con BCG reduce la gravedad de la enfermedad de tuberculosis bovina4. Sin embargo, dado que los animales vacunados con BCG aún pueden desarrollar TB bovina (aunque con menor gravedad), es crucial que comprendamos la capacidad de los reactivos de diagnóstico para detectar estos animales. Con este fin, realizamos tres experimentos de vacunación con BCG/infección por M. bovis para evaluar la sensibilidad relativa de la DST-F en la detección de animales que mostraron evidencia de enfermedad de TB bovina después de la exposición a M. bovis. Los resultados de estos estudios demostraron una sensibilidad relativa alta del 90% (IC 95% de 81% a 95%), que no difirió significativamente (p = 0,348, prueba exacta de Fisher) del valor estimado en no vacunados/M. bovis infectados (Cuadro 3). En comparación con los animales no vacunados, el ganado vacunado con BCG mostró un número reducido de lesiones de TB, la gravedad de las lesiones de TB y el número de bacterias viables recuperadas del tejido afectado11,15,21,22,23. Por lo tanto, se podría esperar que esta reducción de la carga de la enfermedad resulte en una menor activación en curso de las respuestas inmunitarias efectoras a los antígenos micobacterianos, lo que a su vez puede comprometer la sensibilidad de las pruebas de diagnóstico que utilizan estas respuestas como lectura. Con eso en mente, es alentador que la sensibilidad relativa de la DST-F se mantuvo alta en el grupo de animales objetivo, es decir, animales vacunados con BCG que demostraron evidencia de TB bovina luego de la exposición a M. bovis.

Para generar datos de especificidad, el reactivo DST-F se probó en dos grupos de animales: (i) terneros no infectados y (ii) terneros vacunados con BCG. Como se muestra en la Tabla 3, los resultados de estos estudios coincidieron con los datos publicados anteriormente para el cóctel de pruebas cutáneas DIVA18 y confirmaron que el reactivo DST-F mantuvo el alto nivel de especificidad requerido para una prueba DIVA compatible con la vacunación con BCG en condiciones experimentales. Para brindar seguridad adicional al respecto, actualmente se planea una evaluación adicional de la especificidad de DST-F en ensayos de campo (ver más abajo).

Los datos de rendimiento de DST-F presentados en este documento formaron parte de una solicitud a la Dirección de Medicamentos Veterinarios del Reino Unido para obtener un Certificado de prueba en animales (ATC) para permitir el comienzo de las pruebas de campo para DST-F. Esta solicitud también contenía un resumen del proceso de fabricación (proporcionado por Lionex) y los resultados de un estudio de seguridad realizado por la Agencia de Sanidad Animal y Vegetal (APHA) según los estándares de Buenas Prácticas de Laboratorio, en el que se administraron dosis únicas y repetidas de DST-F. evaluado en terneros vacunados con BCG y sin tratamiento previo mediante el control del sitio de inyección y los parámetros generales de salud (incluida la temperatura, las observaciones clínicas y el comportamiento general). La conclusión de este estudio fue que la administración intradérmica de DST-F, ya sea sola o junto con la administración de reactivos de la prueba cutánea de la tuberculina, no causó efectos adversos locales o sistémicos en terneros vacunados con BCG o sin tratamiento previo (datos no mostrados). El ATC se otorgó con éxito y actualmente se están realizando ensayos de campo en el Reino Unido para confirmar inicialmente la seguridad y especificidad del reactivo DST-F en un mayor número de bovinos no vacunados en situaciones de campo, antes de continuar con la evaluación de campo en un gran número de BCG. ganado vacunado, con la intención de que los datos generados a partir de estos estudios respalden una futura autorización de comercialización para el reactivo DST-F.

Se realizaron un total de 3 estudios (Tabla 1; estudios 1-3). En todos los casos, los terneros machos (entre 6 y 12 meses de edad) procedían de rebaños oficialmente libres de TB bovina en GB que no tenían antecedentes recientes de TB bovina y se alojaron en APHA Weybridge durante todo el experimento. Las pruebas cutáneas se realizaron alrededor de 5 a 6 semanas después de la infección. Los detalles de los animales se resumen en la Tabla 1.

Se realizaron un total de 3 estudios (Tabla 1; estudios 4-6). Para los dos experimentos realizados en APHA Weybridge (estudio 4 y 5), se obtuvieron terneros machos (entre 4 y 8 meses de edad) de rebaños oficialmente libres de TB bovina en GB que no tenían antecedentes recientes de TB bovina y se alojaron en APHA Weybridge. a lo largo del experimento. Para el experimento realizado por AgResearch (estudio 6), se obtuvo ganado hembra (de aproximadamente 12 meses de edad) de rebaños acreditados libres de TB de un área de Nueva Zelanda donde los animales de granja y salvajes estaban libres de TB. Los animales se mantuvieron y vacunaron en la granja AgResearch Aorangi, mientras que inmediatamente antes del desafío con M. bovis, el ganado se transportó a la unidad de contención de TB en la granja AgResearch Kaitoke. Las pruebas cutáneas se realizaron entre 8 y 14 semanas después de la infección. Los detalles de los animales se resumen en la Tabla 1.

Se realizaron un total de 2 estudios (Tabla 1; estudios 7 y 8). Para el estudio 7, se obtuvieron terneros machos (entre 8 y 12 meses de edad) de rebaños oficialmente libres de TB bovina en GB que no tenían antecedentes recientes de TB bovina y se alojaron en APHA Weybridge durante todo el experimento. Para el estudio 8, los terneros (de 40 a 54 días de edad) se inscribieron en un estudio de seguridad de DST-F realizado según los estándares de calidad de Buenas Prácticas de Laboratorio (GLP) para generar datos para respaldar una solicitud de Certificado de Prueba Animal a la Dirección de Medicamentos Veterinarios (Weybridge, Reino Unido). ). Como había un requisito esencial del regulador para demostrar que estos terneros estaban libres de TB bovina, se obtuvieron de un lugar conocido libre de TB, Dinamarca. Los detalles de los animales se resumen en la Tabla 1.

Similar a lo descrito anteriormente, los terneros (43–57 días de edad) también se inscribieron en un estudio de seguridad de DST-F en terneros vacunados con BCG. Se realizaron pruebas cutáneas 7 semanas después de la vacunación con BCG. Los detalles de los animales se resumen en la Tabla 1 (estudio 9).

Todos los experimentos con animales vivos se realizaron de acuerdo con las pautas y regulaciones pertinentes, y de conformidad con las pautas ARRIVE. Los procedimientos con animales y los protocolos experimentales fueron aprobados por un comité institucional designado: para el trabajo realizado en APHA, este fue el Consejo de Revisión Ética y de Bienestar Animal de APHA (referencias 70/7737–2-007, PF7D840A5-2-004v, 70/7737–1- 012 y PFFFE51F-2–002), mientras que por trabajo realizado en AgResearch este fue el Comité de Ética Animal de Pastizales (referencia AE 14.741).

Se usó la cepa danesa BCG 1331 (AJVaccines, Copenhague, Dinamarca) para todas las vacunas. Todos los inóculos de BCG se prepararon el día de la vacunación reconstituyendo cada vial de BCG con 1 ml de diluyente Sauton y se administraron 0,5 ml por vía subcutánea a los animales. El inóculo utilizado se tituló mediante diluciones en serie para calcular la dosis real administrada (Tabla 1). En los experimentos de vacuna/desafío, los animales de control no vacunados no recibieron vacuna BCG (estudio 6) o recibieron una inyección subcutánea de 0,5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) (estudios 4 y 5).

Los animales de los estudios 1 a 6 se infectaron experimentalmente por vía endotraqueal/endobronquial con una cepa virulenta de M. bovis (AF2122/97 para los estudios 1 a 5; 83/6235 para el estudio 6). Brevemente, para los estudios 1 a 5, los terneros fueron sedados con Rompun al 2% (0,12 ml/50 kg, vía iv; inversión con la misma dosis de Antisedan, vía iv) antes de la inserción de un endoscopio a través de la cavidad nasal en la tráquea para administración del inóculo (2 ml) a través de una cánula de 1,8 mm de diámetro interno justo debajo de la bifurcación principal entre los lóbulos izquierdo y derecho. Se usaron dos ml de PBS para enjuagar cualquier resto del inóculo de la cánula, y luego se retiraron la cánula y el endoscopio y se descartó la cánula. El canal a través del cual se insertó la cánula en el endoscopio se enjuagó con 20 ml de agua estéril y el exterior del endoscopio se limpió con toallitas esterilizantes antes de infectar al siguiente animal. Para el estudio 6, los terneros se infectaron como se describió previamente21. El M. bovis del inóculo utilizado para infectar al ganado se cultivó para determinar las CFU. Para los experimentos de vacuna/desafío (estudios 4 a 6), los animales se infectaron alrededor de 8 a 10 semanas después de la vacunación. Los detalles de la dosis de desafío y el tiempo de desafío se resumen en la Tabla 1.

Se realizaron exámenes post mortem (PME) en los animales infectados al final del experimento para cuantificar el nivel de patología de TB observado en los pulmones y los ganglios linfáticos utilizando una modificación de un sistema de puntuación publicado previamente24. En la mayoría de los estudios, se examinaron los siguientes ganglios linfáticos: submandibular izquierdo y derecho; retrofaríngea medial izquierda y derecha; mediastino craneal; mediastino caudal; bronquial izquierdo y derecho; y traqueobronquial craneal. Las excepciones fueron los estudios 4 y 5, donde por razones logísticas y prácticas no se examinaron los ganglios linfáticos de la cabeza (submandibular y retrofaríngeo medial). Cada ganglio linfático se cortó en serie en secciones de 1 mm de espesor y se aplicó una puntuación patológica basada en el número y la extensión de las lesiones observadas utilizando los siguientes criterios: puntuación 0 para lesiones no visibles; puntuación 1 para una sola lesión pequeña (1–2 mm de diámetro), puntuación 2 para dos a cinco lesiones pequeñas o una sola área grande (al menos 5 mm por 5 mm); puntuación 3 para entre cinco y veinte lesiones pequeñas o dos o tres áreas grandes; puntuación 4 para más de veinte lesiones pequeñas o más de tres áreas grandes; y puntuación 5 para patología consolidada de más del 50% del ganglio linfático. Además, cada lóbulo de los pulmones se cortó en serie en secciones de 5 a 10 mm y se calificó de la siguiente manera: puntaje 0 para lesiones no visibles; puntuación 1 para una sola lesión pequeña (< 10 mm de diámetro); puntuación 2 para dos a cinco lesiones pequeñas; puntuación 3 para entre cinco y veinte lesiones pequeñas o un área grande única (> 10 mm de diámetro); puntuación 4 para más de veinte lesiones pequeñas o más de un área grande; puntuación de 5 para un área afectada sustancial del pulmón que contiene lesiones. También se recogieron muestras de ganglios linfáticos y tejido pulmonar post mortem para cultivo de M. bovis.

Los tejidos recolectados en PME se almacenaron congelados a -80 °C antes del procesamiento. Brevemente, las muestras individuales se descongelaron, se homogeneizaron en 10 ml de PBS utilizando un mezclador de paletas Seward Stomacher y se extendieron sobre placas de agar 7H11 modificado16. Las placas se incubaron a 37 °C durante un mínimo de 4 semanas antes de la enumeración de colonias individuales en las placas.

Los derivados proteicos purificados de M. avium (PPD-A; 25 000 UI/ml) y M. bovis (PPD-B; 30 000 UI/ml) se obtuvieron de un fabricante comercial (Thermo Fisher, Reino Unido). El reactivo DST-F, que consiste en una proteína recombinante de fusión marcada con histidina de ESAT-6, CFP-10 y Rv3615c en PBS, fue producido por un fabricante comercial (Lionex, Braunschweig, Alemania). Brevemente, la proteína de fusión DST-F se expresó en Escherichia coli (E. coli), se purificó mediante cromatografía de afinidad con níquel, se replegó contra NH4HCO3 10 mM (pH 8,0), se intercambió tampón contra PBS (pH 7,4) y finalmente se diluyó más en PBS para una concentración de 300 µg/ml antes del embotellado en viales de vidrio EP tipo 1 con tapones de cierre y sellados con cápsulas de aluminio. Los criterios de liberación de lotes incluyeron: contenido de proteína de 300 µg/ml ± 5%; Demostración de transferencia Western de una reacción positiva cuando se usan anticuerpos específicos de proteína y etiqueta anti-histidina, pero no hay reacción con un anticuerpo anti-E. anticuerpo coli; una pureza superior al 95 % utilizando SDS-PAGE y análisis densitométrico; contenido de endotoxinas inferior a 25 UI/mg; y esterilidad conforme a la monografía 2.6 de la Farmacopea Europea.

Las pruebas cutáneas se realizaron de acuerdo con las Instrucciones para la prueba de tuberculosis en bovinos, disponibles a través de APHA Vet Gateway. Brevemente, se recortaron los sitios de inyección ubicados en el borde del tercio anterior y medio del cuello a ambos lados del animal y se registró el grosor de la piel antes de la inyección. Las pruebas cutáneas de tuberculina y DST-F se realizaron mediante inyección intradérmica de 0,1 ml de PPD-A y PPD-B, o el reactivo DST-F, respectivamente. Después de 72 h, se comprobaron las reacciones en los sitios de prueba de la piel mediante palpación de la piel. Si se detectaban reacciones palpables, se volvía a medir y registrar el grosor de la piel en el lugar de la inyección. Si no se detectaba una reacción palpable, se usaban los valores previos a la inyección. La excepción a esto fueron los estudios de seguridad GLP (estudios 8 y 9), donde se midió automáticamente el grosor de la piel a las 72 h. Los resultados se expresan como el aumento del grosor de la piel a las 72 h en comparación con el grosor previo a la inyección. Los tiempos de la prueba cutánea para cada experimento se detallan en la Tabla 1.

Los análisis se realizaron con GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, EE. UU.). El grado de patología entre los terneros vacunados con BCG y los de control se comparó mediante la prueba de Mann-Whitney. Se utilizó la prueba de pares emparejados de McNemar o la prueba exacta de Fisher cuando fue apropiado para comparar proporciones de pruebas positivas y negativas. Se consideró estadísticamente significativo un valor de p inferior a 0,05.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Este trabajo fue financiado por el presupuesto de investigación de TB bovina de GB (subvenciones SE3304 y SE3312) mantenido y administrado centralmente por Defra en nombre de Inglaterra, Escocia y Gales. Los autores desean agradecer al personal de APHA de la Unidad de Ciencia Animal por su dedicación al bienestar de los animales alojados en APHA y a la Unidad de Servicios Científicos por realizar los estudios de seguridad de DST-F, y al Dr. Steve Houghton por consultar y aconsejar sobre el requisitos reglamentarios para la solicitud del Certificado de Prueba en Animales para el reactivo DST-F.

TB Inmunología y Vacunología, Departamento de Bacteriología, Agencia de Sanidad Animal y Vegetal, New Haw, Addlestone, KT15 3NB, Surrey, Reino Unido

Gareth J. Jones, Timm Konold, Shellene Hurley, Tom Holder, Sabine Steinbach, Mick Coad y H. Martin Vordermeier

AgResearch, Palmerston North, Nueva Zelanda

D. Neil Wedlock y Bryce M. Buddle

Lionex Diagnostics and Therapeutics GmbH, Braunschweig, Alemania

Mahaveer Singh

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HMV y GJJ desarrollaron el concepto DST-F. MS desarrolló la producción del reactivo DST-F. HMV, GJJ y DNW planificaron los experimentos y coordinaron los estudios con animales. TK, SH, TH, SS, MC y BMB realizaron los estudios con animales y/o experimentos de laboratorio. GJJ analizó los datos y preparó las tablas y figuras. GJJ escribió el texto que fue editado por HMV, DNW y MS

Correspondencia a Gareth J. Jones.

HMV, GJJ, TK, SH, TH, SS y MC son empleados de la Agencia de Sanidad Animal y Vegetal (APHA) que posee 3 patentes para el uso de Rv3615c en pruebas de diagnóstico de TB bovina (WO/2009/060184, WO/2011 /135369 y WO/2012/010875). El trabajo en APHA ha sido financiado por el presupuesto de investigación de TB bovina de GB mantenido y administrado centralmente por Defra en nombre de Inglaterra, Escocia y Gales. MS es el propietario de Lionex GmBH y posee acciones en la empresa. Los restantes autores (DNW y BMB) declaran no tener ningún conflicto de interés potencial.

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Reimpresiones y permisos

Jones, GJ, Konold, T., Hurley, S. et al. Los datos de rendimiento de la prueba demuestran la utilidad de un reactivo de prueba cutánea DIVA para ganado (DST-F) compatible con la vacunación con BCG. Informe científico 12, 12052 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-16092-8

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Recibido: 09 mayo 2022

Aceptado: 01 julio 2022

Publicado: 14 julio 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-16092-8

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