Aislamiento y caracterización molecular de variantes de reovirus aviar emergentes y nuevas cepas en Pensilvania, EE. UU., 2011

Scientific Reports volumen 5, Número de artículo: 14727 (2015) Citar este artículo

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Las infecciones por reovirus aviar (ARV) en parvadas de pollos de engorde y pavos han causado enfermedades clínicas significativas y pérdidas económicas en Pensilvania (PA) desde 2011. La mayoría de las aves infectadas con ARV sufrían de artritis severa, tenosinovitis, pericarditis y crecimiento deprimido o síndrome de retraso en el crecimiento. (RSS). Se observó una alta morbilidad (hasta 20% a 40%) en las parvadas afectadas por ARV y la mortalidad de la parvada llegó ocasionalmente al 10%. Las infecciones por ARV en pavos se diagnosticaron por primera vez en PA en 2011. Entre 2011 y 2014, se realizaron un total de 301 aislamientos de ARV en aves de PA afectadas. La caracterización molecular del gen Sigma C de 114 aislamientos de campo, que representan la mayoría de los brotes de ARV, reveló que solo el 21,93 % de los 114 aislamientos de ARV secuenciados estaban en el mismo grupo de genotipado (grupo 1) que las cepas de la vacuna ARV (S1133, 1733 y 2048). ), mientras que el 78,07 % de los aislamientos secuenciados estaban en los grupos de genotipado 2, 3, 4, 5 y 6 (que eran distintos de las cepas vacunales) y representaban variantes de ARV emergentes. En particular, el grupo de genotipificación 6 fue un nuevo genotipo de ARV que se identificó por primera vez en 10 nuevas variantes de PA ARV de aislamientos de campo.

Los reovirus aviares (ARV) están muy extendidos en la naturaleza y están asociados con una amplia gama de enfermedades que afectan a varias especies de aves1,2, incluidos pollos3,4, faisanes5, pavos6,7, patos8,9,10, gansos11, palomas12, codornices13,14, 15, rapaces16 y psitácidas17. Sin embargo, la mayoría de las enfermedades clínicas por infecciones ARV se observan en pollos de engorde y reproductores de pollos de engorde18. En pollos de engorde jóvenes, los síndromes clínicos más comunes son la tenosinovitis, el síndrome de malabsorción, el síndrome de retraso en el crecimiento (RSS), problemas de enfermedades entéricas e inmunosupresión19,20,21,22,23. Las infecciones por ARV en aves domésticas tienen varios efectos económicamente significativos. Estos incluyen aumento de la mortalidad, falta general de rendimiento, disminución del aumento de peso, mala conversión alimenticia, tasa de crecimiento desigual, comerciabilidad reducida de las aves afectadas, artritis viral/tenosinovitis e infecciones secundarias de otros virus o bacterias2,22.

Los ARV pertenecen al género Orthoreovirus de la familia Reoviridae24,25. Contienen 10 segmentos de genoma de ARN de doble cadena (dsRNA), que incluyen clases de tamaño de 3 L (grande), 3 M (mediano) y 4 S (pequeño) según la movilidad electroforética de los segmentos26. Los hallazgos de la investigación han revelado que la proteína sigma C codificada por el segmento del genoma S1 es la proteína de unión celular y un determinante antigénico importante para los ARV; el segmento del genoma S1 de las cepas ARV de pollo existentes está bien caracterizado y bien conservado en virus de pollos27,28,29,30. Las cepas de ARV de origen pavo que circulan en el medio oeste de los EE. UU. en los últimos años son antigénicamente distintas de las cepas de ARV de origen de pollo. Las cepas de ARV de origen pavo se consideran un subtipo de virus separado dentro del género Orthoreovirus31,32,33.

Las nuevas infecciones ARV emergentes han ocurrido en Pensilvania (PA), EE. UU., desde 2011 y desde entonces han causado enfermedades importantes y pérdidas económicas en la industria avícola de PA. Una estimación conservadora de los costos de estas infecciones ARV en pollos de engorde es de $23 000 por parvada afectada (28 000 aves/parvada) y una compañía de pavos estimó $3 millones en pérdidas en un año. La vacunación contra ARV con vacunas convencionales antes de los brotes observados se había practicado en reproductoras de ponedoras y pollos de engorde. Sin embargo, estas vacunas convencionales no parecían conferir ninguna protección contra las infecciones ARV de campo. Hasta ese momento, las parvadas de pavos reproductores no habían recibido vacunas ARV. No se habían practicado vacunas ARV en parvadas comerciales de ponedoras, pollos de engorde o pavos. Desde la detección de infecciones ARV variantes en parvadas comerciales de pavos y pollos de engorde, la industria avícola ha recurrido a la vacunación de parvadas reproductoras con vacunas ARV autógenas muertas.

Las infecciones ARV en pollos de engorde y pavos se han diagnosticado cada vez más en PA desde 2011 y continúan observándose. Entre 2011 y 2014, 301 casos (parvadas) fueron confirmados como infección ARV por aislamiento del virus en nuestro laboratorio. La mayoría de los casos positivos para ARV involucraron pollos de engorde y pavos enfermos con artritis/tenosinovitis severa, involucrando múltiples articulaciones y tendones de las piernas, incluyendo rodillas, corvejones y almohadillas de las patas, con inflamación que se extiende a la musculatura circundante. A menudo se presentó una alta morbilidad (20-40%) y mortalidad (hasta 10%). Este artículo describe nuestros hallazgos de diagnóstico e investigación en el aislamiento y la caracterización molecular de estas variantes de ARV de PA, EE. UU.

Las infecciones ARV han causado enfermedades clínicas significativas y pérdidas económicas en aves de corral PA desde 2011, particularmente en pollos de engorde y pavos. Las infecciones ARV en pavos fueron diagnosticadas por primera vez en PA en junio de 2011 (Tabla 1, #54: Reo/PA/Turkey/12883/11). Las parvadas de pavos y pollos de engorde infectados con ARV sufren cojera grave y piernas separadas debido a tenosinovitis que abarca las articulaciones femorotibiotarsianas e intertarsianas y la región metatarsiana plantar y, en algunos casos, inflamación que se extiende a la musculatura circundante (Fig. 1a,b). El inicio de la enfermedad generalmente ocurrió entre las 2 y 4 semanas de edad en parvadas de pollos de engorde y a las 10 semanas o más en parvadas de pavos. Se observó comúnmente una alta morbilidad (hasta 20% a 40%) de las aves infectadas con ARV en una parvada y la mortalidad en los casos más severos fue de hasta 10%. La presencia de lesiones patológicas macroscópicas importantes incluía hinchazón marcada, edema, hemorragias en los tendones y las vainas de los tendones y, en casos más crónicos, ruptura total del tendón con hemorragia grave (Fig. 1c, d). Las lesiones de pericarditis también estaban presentes en algunas aves afectadas (Fig. 1e). Microscópicamente, los tipos de células inflamatorias predominantes en los tejidos afectados fueron linfocitos y células plasmáticas (Fig. 1f).

En total, se obtuvieron 301 aislamientos de campo de ARV en nuestro laboratorio entre 2011 y 2014, en su mayoría de tendones y algunos de otros tejidos (corazón, hígado o intestinos) de aves infectadas con ARV. Los aislamientos de virus se realizaron en cultivos celulares en monocapa LMH (ATCC CRL-2113) (Figs. 2, 1a). De los 301 aislamientos de campo de ARV, 206 procedían de pollos de engorde, 18 de ponedoras, 63 de pavos, 7 de perdices chukar, 4 de pintadas, 2 de faisanes de cuello anillado y 1 de codornices (Tabla complementaria 1). Los efectos citopáticos (CPE, por sus siglas en inglés) gigantes o "parecidos a una floración" fueron característicos de las infecciones por ARV en cultivos de células LMH (Figs. 2, 1b-d). Todos los 301 aislamientos de ARV fueron confirmados por células positivas para CPE gigantes o "similares a una floración", que posteriormente se tiñeron como positivas para ARV mediante la prueba de anticuerpos fluorescentes (FA) usando un anticuerpo ARV fluorescente (Fig. 2b-d). Los períodos de incubación para CPE variaron: el CPE más temprano se observó 24 horas después de la inoculación (pi); el último se observó, en algunos casos, después de 4 pases celulares en serie; y para la mayoría de los casos positivos para ARV, se observó CPE de 3 a 5 días pi, dentro de 2 a 3 pases de células en serie.

En total, se seleccionaron 114 aislamientos de campo de ARV que representaban casos de ARV de pollos de engorde, ponedoras, pavos, faisanes y pintadas diagnosticados entre 2011 y 2014 para la caracterización molecular del segmento S1 del gen σC (Tabla 1). Cada uno de los 114 aislados de ARV se amplificó con éxito como un fragmento de 1088 pb mediante RT-PCR basada en S1 utilizando cebadores P1/P434. Luego, el producto de PCR se purificó y se envió a Penn State Genomics Core Facility para la secuenciación del gen S1.

La construcción de árboles filogenéticos y el análisis para la conservación de las secuencias del segmento S1 del gen σC de las 114 cepas de campo de ARV (Tabla 1) con otras 28 secuencias de cepas de referencia (Tabla 2 complementaria) recuperadas de GenBank reveló que las 114 cepas de campo de ARV aisladas de aves de corral PA se agruparon en 6 grupos de genotipificación o genotipos (Fig. 3). De las 114 cepas de campo en estos grupos, 25 (21,93 %) estaban en el mismo grupo (grupo 1) que las cepas estándar de la vacuna ARV (S1133, 1733, 2048); 38 (33,33%) en el conglomerado 2; 7 (6,14%) en el conglomerado 3 y 4; 27 (23,68%) en el conglomerado 5; y 10 (8,77%) en el conglomerado 6 (tabla 2; fig. 3). En particular, el grupo de genotipado 6, o genotipo 6, se identificó por primera vez en 10 cepas de campo de ARV detectadas en aves de corral PA y estas cepas eran nuevas y distintas de todas las cepas de referencia de ARV publicadas anteriormente.

Árboles filogenéticos que muestran 6 grupos de genotipificación (6 colores codificados) de las 114 cepas de campo de reovirus aviar (ARV) aisladas en Pensilvania de los EE. UU., 2011-2014.

El análisis se basó en 300 secuencias de aminoácidos de las secuencias del gen σC. Las longitudes de las ramas son proporcionales a las distancias evolutivas entre secuencias. Las escalas representan sustituciones de nucleótidos por posición. Los nombres de las 28 cepas de referencia de ARV recuperadas de GenBank están solo en los grupos 1-5 (en negrita para distinguirlas de las cepas de campo).

Se realizó una comparación por pares de la predicción de la secuencia de aminoácidos (aa) (1 a 300) para examinar el grado de identidad de la secuencia de los homólogos de los genes σC entre las 114 cepas de campo de PA ARV y las 28 cepas de referencia de ARV recuperadas de GenBank (Fig. . 3). En general, se encontró que las identidades de secuencia de aa de los genes que codifican σC varían drásticamente (40% a 100%) entre las cepas de campo de 114 PA ARV; las similitudes aa fueron inferiores al 60,8 % entre 2 de los 6 grupos de genotipificación; Se observaron varios grados de diferencias entre las similitudes aa dentro de cada grupo.

La clasificación de los grupos y subgrupos de genotipado de ARV se basó en los valores de arranque (análisis realizado con 1000 pseudoréplicas). Cuando las 114 cepas de campo y las 28 cepas de referencia se trazaron juntas para construir árboles filogenéticos (árbol circular o árbol lineal), el árbol circular (Fig. 3) fue mejor que el árbol lineal para ilustrar claramente los grupos y subgrupos.

En el grupo de genotipificación 1 (Fig. 3), las 25 cepas de campo de PA ARV compartían una alta identidad de secuencia (71,0–100 %) y se dividieron en 3 subgrupos diferentes: el subgrupo 1 estaba formado por 16 cepas de pollo de engorde PA, que compartían 98.4–100% aa identidad. El subgrupo 2 estaba formado por 5 estirpes de pollos de engorde y 3 estirpes de ponedoras, que compartían entre un 80,6% y un 97,6% de identidad aa. Las 11 cepas de referencia de ARV, incluidas las cepas de vacuna estándar recuperadas de GenBank y la cepa de pollo de engorde 1 PA restante, formaron el subgrupo 3. Las 24 cepas de campo de ARV PA en los subgrupos 1 y 2 compartieron solo 70,6–88,8% de identidades aa con Cepas de referencia de ARV y 72,1–75,4 % de identidades aa con la cepa de pollos de engorde 1 PA ARV en el subgrupo 3.

En el grupo de genotipado 2, las 38 cepas de campo de PA ARV compartían una amplia gama (58,8–100 %) de identidad de secuencia aa y formaban 3 subgrupos diferentes. El subgrupo 1 estaba formado por pocas cepas de origen de pollo, pero incluía 15 cepas de pavo, 2 cepas de perdiz chukar, 2 cepas de pollos de engorde y 1 cepa de gallina de Guinea y compartían 90,8–100% de identidad aa. El subgrupo 2 constaba de 11 cepas de pollos de engorde y 1 cepa de gallina de Guinea y compartían entre un 78,6% y un 99,1% de identidad aa. El subgrupo 3 incluía 5 cepas de pollos de engorde, 1 cepa de ponedoras y 3 cepas de referencia y compartían entre un 66,0 y un 100 % de identidad aa.

En el grupo de genotipificación 3, 4 de las 5 cepas de pollos de engorde (excepto Reo/Broiler/PA/28439/11) y las 2 cepas de ponedoras compartieron solo 77,8–80,5 % de identidad aa con las 4 cepas de referencia de GenBank. En el grupo 4, todas las 7 cepas de campo de PA ARV se originaron en pollos de engorde y 6 de las 7 compartían una identidad aa alta (93,1–99,1%); la cepa restante (Reo/PA/Broiler/05682/12) tenía una gran similitud con la cepa AVS-B. El grupo 5 constaba de 27 cepas de campo de PA ARV, incluidas 23 cepas de pollos de engorde, 2 cepas de ponedoras, 1 cepa de pavo y 1 cepa de faisán de cuello anillado, con una alta identidad de secuencia aa entre sí (85,2-100%) y estaban moderadamente relacionadas con las 5 cepas de referencia (59,8–80,8%) en este grupo.

En este estudio se identificó por primera vez un nuevo grupo de genotipificación, el grupo 6. Las 10 nuevas cepas de campo de PA ARV, incluidas 9 cepas de pollos de engorde y 1 cepa de pavo, construyeron el nuevo grupo de genotipado 6, que era distinto de los grupos 1 a 5. La identidad compartida de aa fue del 71,0 al 99,9 % dentro del grupo 6, pero del 42,6 al 60,1 %. dentro de los otros 5 grupos.

Las secuencias del gen σC de 114 cepas de campo de ARV caracterizadas por grupos de genotipado σC, que representan los genotipos 1 a 6 detectados en aves de corral PA en los EE. UU., se depositaron en GenBank en octubre (5 de KM #s) de 2014, enero (51 de KP # s) y mayo (58 de KR #s) de 2015 (Tabla 1).

Los tendones y los tejidos sinoviales fueron las muestras preferidas para el aislamiento de ARV de aves que mostraban signos clínicos y lesiones compatibles con los de la infección por ARV1,2,35. También se recolectaron otros tejidos, incluidos el corazón, el hígado y el intestino, en algunos casos cuando se observaron lesiones de pericarditis o cuando estaban presentes signos clínicos de crecimiento deficiente, malabsorción o mala digestión. La necropsia y la recolección de muestras se realizaron en las instalaciones de necropsia del Laboratorio de Diagnóstico Animal de la Universidad Estatal de Pensilvania, de acuerdo con las pautas aprobadas por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA). (http://www.aphis.usda.gov/animal_health/lab_info_services/downloads/NecropsyGuideline.pdf).

Cada muestra de tejido recolectada se picó con tijeras estériles en un recipiente de plástico estéril de 20 ml (Cat No. 14310-684, www.vwr.com) y se diluyó con medio de transporte viral a una dilución de 1:5 (p/v). Luego, la mezcla se colocó en una bolsa Stomacher y se homogeneizó en una licuadora Stomacher (Modelo 80, Seward, Ltd., Reino Unido) durante 2 a 3 min. Posteriormente, el homogeneizado de tejido se transfirió a un tubo cónico de polipropileno estéril de 15 ml y se centrifugó a 1200 rpm durante 10 min a 5 °C. Finalmente, el sobrenadante se recogió y se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,45 nm para estar listo para la inoculación de células para el aislamiento de ARV.

LMH (ATCC CRL-2113) es una línea de células epiteliales de carcinoma hepatocelular primario desarrollada a partir de la transformación química de nódulos tumorales en el hígado de un pollo Leghorn macho mediante un tratamiento a largo plazo con dietilnitrosamina36. La línea celular LMH tiene un fenotipo epitelial y una morfología dendrítica. Las células LMH son muy sensibles a ARV, adenovirus aviares, birnavirus, rotavirus, poxvirus y otros virus aviares probados en nuestros estudios de investigación en curso. Las células LMH se cultivan de forma rutinaria en nuestro laboratorio de virología aviar con el fin de aislar virus aviares para diagnosticar infecciones.

Una preparación de medio de crecimiento celular LMH consta de 500 ml de DMEM/F-12 50/50 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Ham's F-12 50/50 Mix, 1X) con L-glutamina y 15 mM HEPES (Corning Cellgro, Ref. No. 10-092-CV, EE. UU.), 50 ml de suero fetal bovino (FBS), 5 ml de PSA (Pen-Step-Amp) (Cellgro, Ref No. 30-004-CI) y 2,5 ml de sulfato de gentamicina (10mg/ml). La composición del medio de mantenimiento de células LMH es la misma que la del medio de crecimiento, excepto que contiene solo un 2 % (o 10 ml) de FBS. Los procedimientos de cultivo de células LMH son, brevemente, los siguientes: (1) Se tomó un vial de células madre LMH (1 ml preparado por matraz T-25 cm2, al menos 1 × 106/células viables) de un tanque de nitrógeno líquido, se colocó en baño maría a 37 °C para descongelación rápida y luego centrifugado a 1000 rpm por 10 minutos a 4 °C; se descartó el sobrenadante. Como alternativa, se procesó un matraz de cultivo de células LMH en curso para subcultivo en una proporción de 1:4–1:6 por procedimiento de cultivo celular de rutina37; (2) El sedimento celular se resuspendió con 1 ml de medio de crecimiento precalentado y se diluyó en una proporción de 1:20 (es decir, 1 ml de suspensión celular, 19 ml de medio de crecimiento) para los subcultivos de células LMH; (3) La suspensión celular dependía de los matraces (p. ej., 2,5 ml por matraz T-12,5 cm2, 5 ml por matraz T-25 cm2, 1,5–2 ml por pocillo en una placa de cultivo celular de 6 pocillos, o 1 ml por pocillo en una placa de 12 pocillos, que se utilizaban de forma rutinaria con fines de diagnóstico para el aislamiento de virus aviares en nuestro laboratorio); (4) Los matraces sembrados con células LMH se colocaron en una incubadora a 37 °C con 5 % de CO2. Se formó una monocapa confluente dentro de las 48 a 72 horas, dependiendo de la densidad de siembra de las células. Cuando se formó una monocapa de 75% o más de confluencia, los matraces de células LMH estaban listos para usar para la inoculación de muestras para el aislamiento del virus aviar. Los matraces de células LMH sin inocular sirvieron como subcultivos continuos de líneas celulares para hasta 50 o 100 pases. Un matraz de células de siembra se podía mantener durante 1 a 2 semanas y la relación de subcultivo era de 1:4 a 1:8, como en los procedimientos estándar de subcultivo de células37.

Los matraces T12,5 cm2 y las placas de 12 o 24 pocillos de cultivos de células LMH monocapa se utilizaron principalmente para ARV u otros aislamientos de virus aviares en nuestro laboratorio. Se eliminó el medio de cultivo LMH de los matraces de cultivo celular, que luego se enjuagaron con PBS estéril (8,0 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,15 g NaH2PO4, 0,2 g KH2PO4, 1000 ml d-H2O) para eliminar el FBS residual de las células. Los matraces se inocularon con 0,25 ml (para matraces T12.5) o 0,5 ml (para matraces T25) de sobrenadante de cada preparación de muestra. Un matraz de células de control negativo se inoculó con VTM. Los matraces de células inoculados se incubaron en una incubadora a 37 °C para la adsorción del inóculo durante 20 a 30 minutos. Se añadió medio de mantenimiento LMH (2,5–3,0 ml para un matraz T12.5, 2,0 ml/por pocillo para una placa de 12 pocillos, 1 ml/por pocillo para una placa de 24 pocillos) a los matraces y se incubó a 37 °C por debajo del 5% de CO2. Las monocapas inoculadas con muestras se examinaron diariamente durante un período de 5 a 7 días para detectar el desarrollo de efectos citopáticos virales (CPE). Se realizaron rutinariamente de dos a tres pases de células en serie para cada muestra para confirmar los resultados negativos. Los CPE positivos por ARV u otras infecciones por virus entéricos aviares comunes (p. ej., adenovirus, rotavirus, herpesvirus y birnavirus) generalmente se determinaron dentro de 1 a 3 pases celulares.

Los nuevos procedimientos desarrollados por nosotros, que implican la tinción con FA de células ECP tempranas, se utilizaron de forma rutinaria para la detección temprana de ARV en este estudio. Brevemente, estos procedimientos incluyeron los siguientes pasos: (1) Se tomó una muestra de 1 ml de líquido de cultivo celular que contenía células CPE virales (sin terminar los cultivos celulares) de un matraz de cultivo celular inoculado con muestras cuando se observó que las células se sometían a un CPE. y ser liberado al medio desde la monocapa; (2) La muestra de fluido de cultivo celular se centrifugó a 900 rpm para hacer girar las células CPE; (3) El sobrenadante del medio se volvió a transferir al matraz original (que continuó cultivándose) y las células CPE se resuspendieron en PBS en una proporción de aproximadamente 1:5; (4) Las células CPE resuspendidas se colocaron en un portaobjetos de vidrio de microscopio de 25 × 75 × 1 mm (Globe Scientific, Inc., Nueva Jersey, EE. UU.), con 0,1–0,2 ml de PBS (o 1–2 gotas) por muestra. y una forma redonda de 10–12 mm de diámetro para secado al aire; (5) El portaobjetos se fijó con acetona fría (-20 °C) durante 10 min y el área de la muestra se rodeó con un bolígrafo de tinta o un lápiz de diamante; (6) Las células CPE se tiñeron con un anticuerpo anti-ARV marcado con fluorescencia (ID No. 680 VDL 9501, NVSL, Ames, IA, EE. UU.) y el portaobjetos se colocó en una cámara húmeda en una incubadora a 37 °C durante 30– 40 min en la oscuridad; (7) El anticuerpo fluorescente se eliminó enjuagando suavemente un extremo del portaobjetos (sin que se desprendan las células) con PBS y luego se inundó el portaobjetos con PBS durante 2 a 3 minutos para cada uno de los 3 lavados en total; luego, el portaobjetos se colocó boca arriba sobre una toalla de papel para permitir que se secara al aire (o el portaobjetos se colocó en un soporte para portaobjetos y se colocó en un frasco de portaobjetos de vidrio con una barra agitadora en la parte inferior, el frasco de vidrio se llenó con PBS hasta los portaobjetos se cubrieron y el frasco portaobjetos se colocó en una placa agitadora ajustada a una velocidad de agitación suave durante 8–10 min para completar el lavado); (8) El portaobjetos se montó con medio de montaje (tampón PBS al 50 %, glicerol al 50 %, pH 8,4) y la región teñida se colocó bajo un cubreobjetos para su posterior examen. El portaobjetos se mantuvo a temperatura ambiente si la visualización iba a ocurrir dentro de 1 o 2 horas y, de lo contrario, se almacenó en un refrigerador para su visualización dentro de las 24 horas. Las células CPE que dieron positivo para ARV se tiñeron de color verde manzana.

Los procedimientos tradicionales para el aislamiento del virus en cultivos celulares requieren una cantidad significativa de desarrollo de ECP (> 50–70 %) y terminación del cultivo celular para realizar pruebas de identificación de virus posteriores para confirmar un aislado positivo. Mediante el uso de nuestros nuevos procedimientos, particularmente para el aislamiento de ARV en este proyecto, se logró el aislamiento temprano del virus para la mayoría de los casos positivos para ARV. Debido a que solo se requirió una pequeña cantidad de células ECP tempranas (tan solo de 5 a 10) para la confirmación de ARV positivo mediante tinción con FA, nuestros resultados de aislamiento del virus para el diagnóstico de ARV se realizaron 2 a 3 días antes (en promedio) que el momento de la prueba. desarrollando por encima del 50-70% de CPE para la terminación de las placas de cultivo celular.

El ARN viral se extrajo del sobrenadante del cultivo celular utilizando un kit RNeasy Mini (Cat. No. 74106, QIAGEN, Valencia, CA), siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARN extraído se usó como molde para amplificar un fragmento de 1088 pb de un segmento ARV S1 usando los cebadores publicados P1/P434. El ensayo de RT-PCR se llevó a cabo en una mezcla de reacción de 50 μl utilizando un kit de RT-PCR de un solo paso (Cat. No. 210212, QIAGEN, Valencia, CA) que contenía 10 μl de ARN molde, 25 μl de agua libre de RNasa, 10 μl de tampón 5 ×, 2 μl de mezcla de dNTP (10 mM cada dNTP), 1 μl de mezcla de enzimas y 1 μl de cada uno de los dos cebadores. La amplificación se realizó con el termociclador Applied Biosystems 9700 utilizando un paso de transcripción inversa a 50 °C durante 30 min. El paso inicial de activación de la PCR se fijó a 95 °C durante 15 min; luego le siguieron 94 °C por 30 s, 50 °C por 30 s y 72 °C por 90 s de cada ciclo por 38 ciclos; y finalmente se completó con un solo ciclo de 72 °C durante 5 min.

Los productos de RT-PCR del segmento ARV S1 se aislaron y visualizaron en un gel de agarosa teñido con bromuro de etidio. Las bandas específicas de 1088 pb se escindieron y se cargaron en las columnas giratorias de un kit de extracción de gel (Lote No. 04113KE1, Axygen, Tewksbury, MA) usando un procedimiento simple de unión/lavado/elución. El producto de PCR purificado se midió con un espectrofotómetro NanoDrop™1000 (Thermo Scientific, Waltham, MA) y se diluyó a 40 ng/μl para usarlo como molde de secuenciación. Todas las muestras y los cebadores P1/P4 (1 μM) se enviaron a Penn State Genomics Core Facility para la secuenciación de Sanger utilizando el analizador de ADN 3730XL (Applied Biosystems, Grand Island, NY).

Utilizamos métodos de unión de vecinos para el análisis filogenético en este estudio. Se usó Lasergene 12 Core Suite (DNASTAR, Inc., Madison, WI, EE. UU.) para el ensamblaje de datos de secuenciación de Sanger, la predicción de ORF y la traducción de secuencias de nucleótidos. Se emplearon búsquedas BLASTN para investigar las similitudes de secuencia entre las cepas de campo de ARV y las cepas de referencia en GenBank (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Se realizó un análisis filogenético en el segmento S1 (nucleótidos 525–1424) del gen σC (900 bases). Los alineamientos de secuencias se realizaron utilizando el programa ClustalW 1.83 (http://align.genome.jp). Se generaron árboles de unión de vecinos y de máxima verosimilitud (ML) y las topologías de los árboles se validaron mediante análisis de arranque como se implementó en el programa MEGA (Versión 5.0) con distancias absolutas después de 1000 réplicas de arranque38.

Los métodos de diagnóstico clínico y de necropsia se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas aprobadas por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA). (http://www.aphis.usda.gov/animal_health/lab_info_services/downloads/NecropsyGuideline.pdf). Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por la Universidad Estatal de Pensilvania, la Oficina para la Protección de la Investigación.

Aunque el aislamiento del virus requiere mucho tiempo, siempre se prefiere en la virología de diagnóstico y es de vital importancia para descubrir nuevos virus o cepas o variantes de campo emergentes. En este estudio, nuestros procedimientos recientemente modificados para la detección temprana de virus en cultivos celulares se utilizaron de manera efectiva para el diagnóstico temprano de casos de ARV. Tan pronto como se observó una pequeña cantidad de células CPE en cultivos celulares inoculados con muestras, se recolectó una muestra de células CPE para tinción con ARV FA para confirmar los resultados del aislamiento del virus sin terminar los cultivos celulares. Esto permitió un diagnóstico más temprano que los procedimientos tradicionales de aislamiento de virus, que requieren esperar hasta el 50-70% del desarrollo de CPE. En promedio, el virus se aisló 2 o 3 días antes para la mayoría de los casos de ARV mediante el uso del nuevo procedimiento. Además, el nuevo procedimiento proporciona resultados claros debido al uso de células CPE concentradas y permite la detección simultánea de virus sospechosos adicionales mediante la preparación de portaobjetos duplicados.

σC es la proteína más variable en ARV39. Interviene en la unión del virus a las células diana y los anticuerpos específicos para σC neutralizan las infecciones por ARV40,41. En este estudio, los hallazgos de nuestra investigación del análisis filogenético de las secuencias del gen σC revelaron que las 114 cepas de campo de ARV eran genéticamente diferentes y se agruparon en 6 grupos de genotipificación o genotipos (Fig. 3); 90 de los 114 aislamientos, en los grupos 2 a 6, eran variantes de campo y distintas de las cepas estándar de la vacuna ARV (S1133, 1733, 2408), que se agrupan en el grupo 1. Más importante aún, se creó un nuevo grupo de genotipificación (grupo 6). identificada en este estudio por primera vez. Las 10 nuevas cepas de campo de ARV detectadas en aves de corral PA (9 de pollos de engorde, 1 de pavos) formaron el nuevo grupo 6 de genotipado de ARV y las cepas exhibieron una alta diversidad genética (hasta un 30 % de diferencia entre sí).

Dentro del grupo de genotipificación 1, 24 de las 25 cepas de campo de ARV PA formaron subgrupos separados que muestran diferencias con el subgrupo de cepas de la vacuna ARV y la baja identidad aa (70,6–88,8%) entre estos subgrupos indica que los 24 PA ARV las cepas de campo no son idénticas a las cepas de la vacuna o posiblemente sean variantes de campo relacionadas con la vacuna. De manera similar, también se observaron variaciones de identidad de aa entre subgrupos en los grupos de genotipado 2, 3, 4 y 5, en los que la mayoría de las cepas de campo de PA ARV formaron sus propios subgrupos, distinguiéndolas de las cepas de referencia de ARV detectadas en otros lugares ( Países Bajos, Alemania, EE. UU. y Taiwán) (Fig. 3; S Tabla 2). No obstante, el novedoso grupo de genotipado 6 y las nuevas cepas o variantes de campo emergentes en los grupos 1 a 5 indican que se han producido mutaciones o recombinaciones revolucionarias de ARV o que están ocurriendo continuamente, lo que puede continuar produciendo variantes de campo de ARV adicionales o cepas nuevas.

En el grupo de genotipificación 2, el subgrupo 1 constaba de 15 cepas de pavo, 2 cepas de chukar, 2 cepas de pollo de engorde y 1 cepa de gallina de Guinea detectadas en PA. Estas cepas de campo de PA ARV tenían una homología de nucleótidos que oscilaba entre 90,8 % y 100 % entre sí y entre 92,3 % y 99,8 % con las 3 cepas MN de ARV de pavo que ocurrieron en 201133, lo que sugirió que estas cepas de PA ARV probablemente se transmitieron desde el Medio Oeste. cepas de origen pavo.

Debido a que cada cepa de ARV contiene 10 segmentos genómicos de clases de tamaño 3 L (grande), 3 M (mediana) y 4 S (pequeña)26, las caracterizaciones de secuenciación del genoma completo pueden proporcionar información genómica más detallada para las cepas de campo de ARV de interés. Mediante el uso de procedimientos tradicionales de secuenciación del genoma42, llevamos a cabo una caracterización genómica completa de la cepa de campo ARV de pollos de engorde PA (Reo/PA/Broiler/05682/12)43. Nuestros hallazgos de secuenciación del genoma de este ARV de pollo de engorde revelaron que la mayor similitud de secuencia se observó con la cepa clásica AVS-B en el segmento S1 del gen σC. La cepa de campo de ARV de pollos de engorde era solo moderadamente similar a los segmentos M2 y M3 de la cepa AVS-B y la similitud de secuencia más baja apareció en la secuencia más 5' del segmento del genoma M2.

Actualmente estamos realizando estudios de caracterización de secuenciación de genoma completo en las variantes de ARV emergentes y cepas novedosas mediante el uso del sistema Illumina MiSeq de Next Generation Sequencing (NGS)44, que nos permite determinar las ubicaciones de los genes mutados en las secuencias completas de los 10 genomas. segmentos Recientes descubrimientos científicos que resultaron de la aplicación de tecnologías NGS resaltan el sorprendente valor de usar plataformas masivamente paralelas para análisis genéticos45,46,47,48,49. Estos nuevos métodos han ampliado las lecturas previamente enfocadas de una variedad de protocolos de preparación de ADN a la escala de todo el genoma y han ajustado la resolución de estas lecturas a una precisión de base única. La secuenciación del ARN también ha avanzado y ahora incluye análisis de ADNc de longitud completa, análisis en serie de métodos basados ​​en la expresión génica y descubrimiento de ARN no codificante. Por lo tanto, la aplicación de metodologías NGS para continuar con esta investigación de ARV generará información completa sobre la secuencia genómica de las nuevas variantes y nuevas cepas del campo ARV y nos permitirá comprender mejor cómo estas nuevas cepas lograron cambios genómicos revolucionarios.

El enfoque de control más crítico para limitar la enfermedad clínica asociada con las infecciones ARV es vacunar a los reproductores adecuadamente con vacunas eficaces, reduciendo así el potencial de transmisión vertical y proporcionando a la progenie anticuerpos maternos específicos que protegen contra las cepas de campo actuales. Además de la caracterización de la secuenciación del segmento S1 del gen σC informada en este estudio, la caracterización completa del genoma de las nuevas cepas de campo ARV proporcionará datos científicos más detallados, lo que nos permitirá comprender mejor las mutaciones ARV, las recombinaciones y las características de epidemiología molecular relacionadas. Estos estudios ayudarán a desarrollar vacunas autógenas efectivas de virus muertos y virus vivos y otras estrategias de protección.

Cómo citar este artículo: Lu, H. et al. Aislamiento y caracterización molecular de variantes de reovirus aviar emergentes y nuevas cepas en Pensilvania, EE. UU., 2011–2014. ciencia Rep. 5, 14727; doi: 10.1038/srep14727 (2015).

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Descargar referencias

Estos estudios de diagnóstico e investigación de reovirus aviares fueron financiados por el Programa de Investigación de la Comisión de Salud y Diagnóstico Animal (AHDC) del Departamento de Agricultura de Pensilvania (PDA), 2013–2015, Pensilvania, EE. UU.; El Programa de investigación de control de huevos/pollos de la industria avícola de Pensilvania y el Programa de investigación de la Junta de soja de Pensilvania, 2015, Pensilvania, EE. UU.

Laboratorio de Diagnóstico Animal, Departamento de Ciencias Veterinarias y Biomédicas, Universidad Estatal de Pensilvania, University Park, 16802, PA

Huaguang Lu, Yi Tang, Patricia A. Dunn, Eva A. Wallner-Pendleton, Lin Lin y Eric A. Knoll

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HL escribió el texto principal del manuscrito, preparó tablas (1, 2, S1, S2) y figuras (1a, 1b y 2), supervisó el proyecto y ayudó en el aislamiento de virus y estudios moleculares. YT realizó los estudios de caracterización molecular y el análisis de datos de secuenciación, preparó la Figura 3 y ayudó a las Tablas 1, 2 y S2. PAD y EAW realizaron investigaciones de campo, diagnósticos clínicos y patológicos y colecciones de muestras y prepararon la Figura 1(c–f). LL realizó cultivos de células LMH, aislamientos de virus y pruebas de FA y pruebas moleculares asistidas, Tabla S1 y Figura 2. EAK realizó procesamiento de muestras y aislamiento de virus asistido y Tabla S1. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Signos clínicos y lesiones patológicas de las infecciones por reovirus aviar en pollos de engorde.

(a) Casos de pollos de engorde con tenosinovitis severa a las 4 semanas de edad; (b) Tenosinovitis asociada con toda la pierna; (c) Hinchazón, edema y hemorragias en los tendones y vainas tendinosas; (d) Rotura de tendón de espesor total; (e) Lesiones de pericarditis; (f) Lesiones microscópicas de tenosinovitis plasmocítica linfocítica crónica en un corte transversal de tendón, membrana sinovial y tejidos asociados cerca de la articulación intertarsiana.

Detección de reovirus aviar (ARV) mediante la prueba de anticuerpos fluorescentes (FA) en células de efecto citopático (CPE) infectadas con reovirus.

(1a) Control negativo de cultivos de células normales LMH; (2a), (3a) y (4a) Células CPE gigantes, o "similares a una floración", características de las infecciones por ARV en cultivos de células LMH; (1b) prueba FA negativa en células LMH normales; (2b), (3b) y (4b) Pruebas positivas de FA en células CPE infectadas con ARV. Nota: La hoja de células LMH no infectadas teñidas con FA (1b) y las hojas de células infectadas con ARV (2b, 3b, 4b) se recolectaron de los cultivos de células LMH correspondientes (1a, 2a, 3a, 4a) en aproximadamente 1 ml de medio de cultivo y luego preparado en portaobjetos de vidrio para la prueba de FA.

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

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Reimpresiones y permisos

Lu, H., Tang, Y., Dunn, P. et al. Aislamiento y caracterización molecular de variantes de reovirus aviar emergentes y nuevas cepas en Pensilvania, EE. UU., 2011–2014. Informe científico 5, 14727 (2015). https://doi.org/10.1038/srep14727

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Recibido: 02 Abril 2015

Aceptado: 07 de septiembre de 2015

Publicado: 15 de octubre de 2015

DOI: https://doi.org/10.1038/srep14727

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