Los medios de cultivo orgánicos y minerales tienen una estructura comunitaria, estabilidad y funcionalidad distintas en los sistemas de cultivo sin suelo

Scientific Reports volumen 6, Número de artículo: 18837 (2016) Citar este artículo

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La elección del medio de cultivo sin suelo para la nutrición, el crecimiento y el apoyo de las plantas es crucial para mejorar la ecosostenibilidad de la producción en los sistemas hortícolas. Como nuestra comprensión actual de las comunidades microbianas funcionales que habitan en este ecosistema aún es limitada, examinamos el desarrollo de la comunidad microbiana de los dos medios de cultivo más importantes (orgánico y mineral) utilizados en sistemas hortícolas abiertos sin suelo. Nuestro objetivo fue identificar los factores que influyen en la composición de la comunidad a lo largo del tiempo y comparar la distribución de taxones individuales en los medios de cultivo y su funcionalidad potencial. El análisis de secuenciación de alto rendimiento reveló una comunidad microbiana distintiva y estable en el medio de cultivo orgánico. La humedad, el pH, el nitrato-N, el amonio-N y la conductividad fueron descubiertos como los principales factores asociados con las comunidades bacterianas residentes. El N-amonio se correlacionó con la abundancia de Rhizobiaceae, mientras que se sugirieron posibles interacciones competitivas entre Methylophilaceae y Actinobacteridae con Rhizobiaceae. Nuestros resultados revelaron que los medios de cultivo sin suelo son nichos únicos para diversas comunidades bacterianas con estabilidad funcional temporal, lo que posiblemente puede afectar la resistencia a fuerzas externas. Estas diferencias en las comunidades se pueden utilizar para desarrollar estrategias para avanzar hacia una horticultura sostenible con mayor productividad y calidad.

En EE. UU., Canadá y Europa, el 95 % de las hortalizas de invernadero, en particular los tomates, se producen en sistemas de cultivo de plantas de invernadero sin suelo utilizando medios de cultivo hortícolas1. Los sistemas hortícolas abiertos sin suelo tienen ventajas sobre los sistemas tradicionales en el sentido de que los nutrientes, el oxígeno y el agua necesarios para un crecimiento saludable de las plantas están controlados2 y los patógenos transmitidos por el suelo pueden evitarse3,4. En Europa occidental, casi todos los tomates cultivados en invernaderos se producen en un medio de cultivo mineral compuesto por fibras sintéticas inorgánicas5. Los sustratos de cultivo minerales se producen a partir de diabasa, piedra caliza y coque, que se funden a 1500 °C y se hilan en fibras6. Por el contrario, la turba y el coco son los componentes de origen orgánico más utilizados en los medios de cultivo producidos en la UE7. Mientras que el medio de cultivo mineral tiene un pH neutro, alto contenido de aire y baja densidad, el medio de cultivo orgánico se caracteriza por su alto contenido de materia orgánica y capacidad de intercambio catiónico con la solución de agua que irriga el medio de cultivo. A pesar de estas diferencias, el rendimiento y el número de frutos de tomate (Solanum lycopersicum) fue comparable entre plantas cultivadas en sustratos minerales u orgánicos durante varios años consecutivos8.

La sostenibilidad de los sistemas de invernadero sin suelo depende en gran medida del aumento de los rendimientos y de la eficacia general del proceso de cultivo4. Se toman medidas de desinfección en el invernadero para garantizar el rendimiento final y la calidad4. Sin embargo, esto da como resultado la eliminación no solo de microorganismos nocivos sino también de taxones microbianos potencialmente beneficiosos para la planta. En última instancia, esto puede evitar que la comunidad alcance el equilibrio y la estabilidad, lo que hace que estos sistemas de cultivo sin suelo corran el riesgo de una invasión de patógenos exitosa4. La biodiversidad protege a los ecosistemas contra la disminución de su funcionalidad, como consecuencia de la redundancia funcional por la coexistencia de múltiples especies9,10. Esto también puede conducir a una mayor productividad11, debido al impacto positivo en la respiración bacteriana, la producción de biomasa microbiana y el almacenamiento de nutrientes de las plantas. Además, se ha informado una mayor estabilidad funcional temporal y resistencia a fuerzas externas, como perturbaciones de nutrientes y especies invasoras10,12.

La compleja comunidad microbiana asociada a las plantas, también conocida como el "segundo genoma de la planta", es crucial para la salud, el crecimiento y el desarrollo de las plantas13. El trabajo anterior que investiga las comunidades microbianas asociadas con los medios de cultivo se ha centrado principalmente en la ausencia de bacterias y hongos patógenos14. Existe una comprensión limitada de los factores que influyen en la composición de la comunidad a lo largo del tiempo, la distribución de taxones individuales en los medios de cultivo y su funcionalidad potencial. La falta de estrategias de control efectivas que apunten a mejorar la productividad15 aumenta nuestra necesidad de monitorear de cerca la rizósfera, el medio de cultivo y sus poblaciones microbianas.

En este estudio, examinamos el desarrollo de la comunidad microbiana de los dos medios de cultivo más importantes utilizados en sistemas hortícolas abiertos sin suelo: orgánico (GB) y mineral (RW). Presumimos que los medios de cultivo RW y GB desarrollan una estructura comunitaria diferente con funcionalidades potencialmente únicas. Gran parte de la fluctuación dentro de la rizosfera está definida por la raíz de la planta y las condiciones en el medio de crecimiento. Por lo tanto, la rizósfera y la comunidad microbiana asociada con el medio de cultivo están fuertemente conectadas. El conocimiento sobre estas diferencias se puede utilizar para desarrollar estrategias hacia una horticultura sostenible, con productividad y calidad mejoradas y una resistencia potencialmente mayor a las fuerzas externas12. El síndrome de las raíces peludas causado por la infección por Agrobacterium rhizogenes es un problema importante en la horticultura de invernadero, porque el rendimiento total puede disminuir hasta en un 10 % en las plantas de tomate16. En nuestro estudio, se detectó una infección natural por A. rhizogenes en algunas plantas que crecían en el medio RW (RWS). También se evaluaron las interacciones que ocurren entre las raíces, la rizosfera y el medio de cultivo y la resistencia potencial a las fuerzas externas, representada en nuestro estudio por A. rhizogenes.

Chitinophagaceae, Xanthomonadaceae, Flavobacteriaceae, Hypomicrobiaceae, Microbacteriaceae, Comamonadaceae, Enterobacteriaceae, Methylophilaceae, Rhizobiaceae, Pseudomonadaceae y Sphingobacteriaceae fueron las familias bacterianas con mayor abundancia relativa en ambos medios de cultivo (Fig. 1A). Chitinophagaceae, Methylophilaceae e Hypomicrobiaceae fueron abundantes en GB, mientras que Microbacteriaceae aumentó en RW. Enterobacteriaceae, Verrucomicrobiaceae y Rhizobiaceae fueron abundantes en RWS y disminuyeron en GB (Cuadros 1 y 2). El análisis de varianza multivariante permutacional (PERMANOVA) confirmó que el tipo de medio de crecimiento, pero no el punto de tiempo, contribuyó significativamente a las diferencias en las abundancias relativas de las familias bacterianas (P < 0.05, Fig. 1B). El análisis de los perfiles de DGGE mostró que las muestras de RWS se agruparon independientemente del tiempo, mientras que el resto de las muestras tendieron a agruparse según el punto de tiempo (Figura 1 complementaria). El número total de especies fue mayor en GB (P <0,05), mientras que la diversidad y la uniformidad entre GB y RW fueron significativamente diferentes en los puntos de tiempo (P <0,05, Tabla complementaria 1). RW y RWS mostraron similitudes consistentes en sus métricas de diversidad y uniformidad (Tabla complementaria 2).

(A) Abundancias relativas de las familias bacterianas presentes en los medios de cultivo hortícolas. Se indican las familias con el mayor recuento de secuencias y su correspondiente clasificación RDP. RW: medio de cultivo mineral; GB: medio de cultivo orgánico, RWS: medio mineral con raíces peludas. El conjunto de datos se redujo al recuento de secuencias más bajo; las abundancias relativas se calcularon sumando los recuentos de UTO pertenecientes a la misma familia. (B) La estructura de la comunidad fue significativamente diferente entre los tipos de medios de cultivo. Se realizó un análisis de homogeneidad multivariante de las dispersiones de grupo (varianzas) y se utilizó un análisis de escalamiento multidimensional no métrico para evaluar la similitud entre las comunidades bacterianas. Los símbolos indican el tipo de medio de cultivo: círculos, medio de cultivo orgánico (GB); triángulos, medio de cultivo mineral (RW); cuadrados, medio de cultivo mineral con raíces peludas (RWS). El número en la leyenda especifica el punto de tiempo y la letra se refiere a la réplica de la muestra. Por ejemplo, "GB1A" se refiere a la réplica "A" del medio de cultivo orgánico, recolectada en el primer momento.

El Análisis de Factores Múltiples (MFA) mostró que las familias asociadas con GB estaban representadas en la Dimensión 1 (P < 0.0001, Fig. 2A), lo que explica el 28% de la varianza en las abundancias relativas entre todas las muestras. Gemmatimonadaceae, Sinobacteraceae, Sorangiineae, Opitutaceae, Desulfobacteraceae, Actinobacteridae, Hahellaceae, Gaiellaceae, Hypomicrobiaceae, Methylophilaceae, Acetobacteraceae, Methylocystaceae, Conexibacteriaceae, Xanthobacteraceae y Nitrospira no clasificada se asociaron significativamente con GB. Las familias bacterianas que se correlacionaron con RW se representaron en Dim. 3 (P < 0.05) y explicó el 11% de la varianza total. Pseudonocardineae, Propionibacterineae, Bacteroidaceae, Commamonadaceae, Incertae Rhizobiales y Cryomorphaceae se asociaron a esta dimensión. Rhizobiaceae, Verrucomicrobiaceae, Planctomycetaceae, Simkaniaceae, Piscirickettsiaceae y Caldilineaceae fueron familias asociadas con RWS e incluidas en Dim. 5 (P <0,05, Tabla complementaria 3).

(A) Variaciones en la abundancia de familias bacterianas en medios de cultivo hortícolas. Según el círculo de correlación, las familias pertenecientes al primer componente del Análisis Factorial Múltiple (Dim. 1) se correlacionan negativamente con la abundancia de especies pertenecientes a Rhizobiaceae (23). Dado que hay más familias en Dim 3., su contribución a la varianza general entre muestras es menor. La dimensión 3 describió las familias que se correlacionaron significativamente con RW (P < 0,05). 1, Propionibacterineae; 2, pseudonocardineae; 3, Rhodobacteraceae; 4, Caedibacter; 5, Incertae Rhizobiales; 6, Nitrospira sin clasificar; 7, metilfiláceas; 8, Gaiellaceae; 9, Acetobacteraceae; 10, Actinobacteridae; 11, Xanthobacteraceae; 12, Hahellaceae; 13, Sinobacteraceae; 14, Desulfobacteraceae; 15, Hyphomicrobiaceae; 16, Opitutaceae; 17, gemmatimonadáceas; 18, Metilocistáceas; 19, Sorangiineae; 20, Hyophomonadaceae; 21, cromatiáceas; 22, rodocicláceas; 23, Rhizobiaceae. (B) El mapa de análisis de factores múltiples indicó que las muestras del medio de cultivo orgánico (GB) mostraron abundancias similares en todos los puntos de tiempo y diferían de las del medio mineral (RW). Las abundancias de familias bacterianas en muestras de RW con raíces peludas (RWS) fueron similares a las de RW. Los símbolos indican el tipo de medio de cultivo: círculos negros para GB, triángulos grises para RW y cuadrados blancos para RWS. El número en la leyenda especifica el punto de tiempo y la letra se refiere a la réplica de la muestra. Por ejemplo, el círculo etiquetado como "1A" se refiere a la réplica "A" de GB, recopilada en el primer momento.

La prueba de Tukey para las comparaciones por pares de las dispersiones medias de los grupos se realizó con el paquete vegano en R. Como lo demuestran las medidas de diversidad y uniformidad (Tablas complementarias 1 y 2), la interacción entre el tiempo y el tipo de medio de cultivo fue significativa en el tercer punto temporal ( p < 0,05). Con base en las abundancias relativas de las familias bacterianas y en las medidas de diversidad alfa y uniformidad, validamos la presencia de comunidades microbianas distintivas y estables asociadas con cada medio de cultivo (Tablas 1 y 2 y Fig. 2B).

El rendimiento de la planta se determinó al final de la temporada de crecimiento tanto para el medio de cultivo orgánico como para el mineral y dio como resultado un rendimiento acumulado total (peso fresco) de 59,27 ± 1,52 kg.m−2 y 61,59 ± 0,86 kg.m−2 respectivamente. Calcio, magnesio, sulfato, nitrato-N, sodio y conductividad fueron mayores en GB que en RW Calcio, magnesio, sulfato, nitrato-N, sodio y conductividad fueron mayores en GB que en RW (P < 0,05). en RW (P <0,05), mientras que el amonio-N, el potasio, el hierro y el manganeso fueron significativamente más altos en RW en comparación con GB (P <0,05, Tabla complementaria 4). El N-amonio, el pH, la conductividad, el potasio, el sodio, el hierro y el cloruro fueron los más altos en RWS (P <0.05, Tabla complementaria 5). Las correlaciones positivas entre la conductividad y el nitrato-N se detectaron consistentemente en GB, mientras que el amonio-N se asoció con el total de CFU solo en el tercer punto de tiempo (P < 0.05, Tabla 3). En RW, el pH se correlacionó positivamente con Agrobacterium sp. CFU, mientras que la conductividad, el N-amonio, los sulfatos y el sodio se correlacionaron negativamente con el total de CFU. Solo los sulfatos se correlacionaron positivamente con el sodio en todos los puntos de tiempo (P < 0,05, Tabla 4). Correlaciones positivas entre calcio y Agrobacterium sp. y CFU totales se encontraron en RWS en todo momento (P < 0.05, Tabla 5). En contraste, la humedad se correlacionó negativamente con Agrobacterium sp. y CFU totales cuando se detectaron por primera vez las raíces peludas (P < 0,05). El objetivo de la MFA era doble: discriminar los medios de cultivo en función de las variables medidas y descubrir las correlaciones entre las características fisicoquímicas y biológicas dentro del medio de cultivo. En general, MFA mostró que las bacterias totales, Agrobacterium sp. Las CFU, la humedad, el pH, el sulfato y la conductividad fueron las características con mayor contribución a la varianza total entre las muestras (Fig. 3A). Amonio-N y Agrobacterium sp. Las UFC fueron las dos variables con la correlación más alta con la Dimensión 1 (P < 0,0001, Tabla complementaria 6), que representaron el 29,8 % de la varianza. Las razones de correlación cuadrática miden el grado de asociación entre las variables y un eje en particular. Por lo tanto, el cos2 entre las coordenadas de las muestras y el tipo de medio de cultivo reveló que las anteriores eran las principales características que describían el medio RWS en Dim. 1 (cos2 > 0,5). Oscuro. 2 (26,7% de la varianza total) se construyó por las características de GB (sulfato, conductividad, sodio, magnesio, calcio y nitrato-N), mientras que en Dim. se incluyeron potasio, manganeso, hierro y humedad. 3 con RW (P < 0,05, 13,6% de la varianza). Confirmamos que cada medio de cultivo se caracterizó por un conjunto único de variables fisicoquímicas y biológicas, que se conserva a lo largo del tiempo (Fig. 3B).

Las características físicas y químicas de los medios de cultivo son únicas para cada entorno.

(A) Análisis de factores múltiples de las características físicas y químicas de los medios de cultivo hortícolas. El círculo de correlación indica la contribución de las variables que impulsan las diferencias entre los medios de cultivo. Los vectores largos en la misma dirección indican correlaciones positivas entre variables, mientras que los vectores largos en la dirección opuesta indican correlaciones negativas. (B) El análisis de factores múltiples destacó las similitudes entre las muestras de medios de cultivo a lo largo del tiempo, en función de sus características físicas y químicas. Los símbolos indican el tipo de medio de cultivo: círculos negros para GB, triángulos grises para RW y cuadrados blancos para RWS. El número en la leyenda especifica el punto de tiempo y la letra se refiere a la réplica de la muestra. Por ejemplo, el círculo etiquetado como "1A" se refiere a la réplica "A" de GB, recopilada en el primer momento.

En lugar de calcular los coeficientes de correlación de Pearson entre cada par de variables, se infirieron redes bipartitas utilizando una matriz de similitud por pares obtenida del Análisis de correlación canónica regularizada (Fig. 4). Los valores de la matriz de similitud se calcularon como la correlación entre las abundancias relativas de las familias bacterianas y las características del medio de crecimiento proyectado en el espacio ocupado por los primeros componentes retenidos en el análisis. Se obtuvieron tres componentes relevantes estableciendo un umbral de 0,5. De esta forma, el N-amonio se correlacionó con la abundancia de Rhizobiaceae. Las familias asociadas a RW se correlacionaron con hierro (P < 0,05), mientras que potasio, magnesio, calcio y nitratos se asociaron con GB (P < 0,05). Se utilizó el análisis de correspondencia (CA, figura complementaria 2) para revelar la asociación entre el medio de cultivo (filas) y las variables fisicoquímicas y las abundancias relativas (columnas). La estadística de chi-cuadrado indicó un fuerte vínculo entre el medio de cultivo y las variables fisicoquímicas y abundancias relativas (P < 0,05). Las coordenadas de las variables de fila/columna representan el número de desviaciones estándar que las variables de fila/columna están alejadas del baricentro17. Por lo tanto, las coordenadas más altas en Dim.1 pertenecieron a Agrobacterium sp. CFU, Solimonadaceae, Ammonia-N y P (filas) y RWS y el punto de tiempo 3 (columnas), los cuales explicaron el 92,9% de la varianza. Oscuro. 2 fue impulsada por las relaciones entre las familias más abundantes detectadas en GB en el momento 2. Las interacciones observadas confirmaron los resultados de los análisis de correlación anteriores (Tablas 1 y 2).

Gráfico de red basado en las correlaciones canónicas regularizadas entre la abundancia de la familia bacteriana y las características fisicoquímicas del medio de cultivo.

Las correlaciones (r) se han filtrado para una correlación absoluta superior a 0,5 y están coloreadas siguiendo la clave que se muestra. De acuerdo con el algoritmo gráfico, las correlaciones más fuertes son líneas más cortas y las familias con abundancias similares dentro del medio de cultivo tienden a agruparse estrechamente. Esta representación revela la relación entre grupos de familias vinculados a las diferentes características físicas y químicas del medio ambiente, lo que potencialmente revela poblaciones específicas de medios de crecimiento. En verde, familias bacterianas correlacionadas con RW; en rojo, familias bacterianas asociadas con RWS, en violeta, familias correlacionadas con GB.

Se determinó la curva de retención de agua de los dos medios de cultivo. El contenido volumétrico de agua saturada de RW (θs = 0,9834) coincidió con informes previos de Wallach18, mientras que el contenido volumétrico de agua saturada de GB fue θs = 0,935. El contenido volumétrico de agua (θv = 85,3 %) de RW corresponde a un potencial matricial de −0,6 kPa, mientras que θv = 83,1 % para RWS corresponde a un potencial matricial de −0,61 kPa. Para el medio de cultivo orgánico, θv = 81,93 % representa un potencial matricial de −0,46 kPa.

Siete muestras de RW (46,7% de quince) fueron positivas para A. rhizogenes biovar 2, mientras que las muestras de GB fueron negativas para cualquiera de las especies analizadas de Agrobacterium sp. (Cuadro complementario 7). Fitopatógeno Agrobacterium sp. Las cepas albergan los genes necesarios para el proceso y la transferencia de T-DNA en las regiones de virulencia (virC) de los plásmidos inductores de raíces (pRi)19,20. Por lo tanto, las muestras de RW positivas para A. rhizogenes biovar 2 y todas las muestras de RWS se examinaron para detectar la presencia del gen de patogenicidad virC y todas las RWS dieron positivo. Los recuentos en placa en el medio selectivo confirmaron los resultados de la PCR multiplex. Los resultados de la PCR de colonias en aislamientos de tipo salvaje seleccionados al azar validaron la presencia del gen virC y de A. rhizogenes biovar 2 en RWS (Tabla complementaria 7). Diferencias en Agrobacterium. sp. Las CFU entre los medios de cultivo estuvieron influenciadas por el tiempo y fueron más bajas en RW en comparación con RWS (P < 0.05, Tabla complementaria 7).

Con base en las abundancias relativas de las familias asociadas con cada medio de cultivo, validamos la presencia de una estructura comunitaria microbiana competitiva, distintiva y estable en el medio de cultivo orgánico. Además, identificamos la humedad, el contenido de potasio, el pH y la conductividad como las principales características fisicoquímicas que impulsan las comunidades microbianas en el medio de cultivo.

La secuenciación de alto rendimiento combinada con técnicas moleculares descubrió la estructura de la microbiota asociada al medio de crecimiento. GB albergaba una mayor diversidad bacteriana que RW y RWS. Además, GB mostró abundancias similares de familias bacterianas en todos los puntos de tiempo, mientras que tanto RW como RWS mostraron una mayor variabilidad. Estas diferencias podrían estar asociadas con la diferente estructura y composición de los dos tipos de medio de cultivo, que pueden proporcionar nichos únicos para la comunidad microbiana21. La densidad y la biodiversidad de la comunidad microbiana pueden verse afectadas por la edad del medio de cultivo22. La biodiversidad en sistemas sin suelo con sustratos de cultivo minerales es baja al comienzo de un cultivo4, luego aumenta en unas semanas23 y se estabiliza después de seis semanas de crecimiento de la planta24. Como se describió en informes anteriores21, nuestro medio RW sin cultivar mostró bajas cantidades de nutrientes y bacterias totales CFU (<102 CFU g-1) en comparación con GB (2.2 × 107 CFU g-1). Se ha realizado la cuantificación de recuentos de células viables (UFC) de la microflora aeróbica cultivable que coloniza diferentes partes del sistema, como la zona de raíces, la solución nutritiva, los medios de cultivo y los dispositivos del sistema (tubos, canaletas, etc.)25. Sin embargo, solo entre el 1 y el 10 % de la microflora puede recuperarse con técnicas basadas en un cultivo en placa en agar R2A, lo que proporciona información limitada sobre toda la comunidad presente en cada medio de cultivo. Por ello, complementamos los estudios de cultivo con la caracterización molecular de las comunidades microbianas.

El aumento de la biodiversidad microbiana observado en el medio de cultivo se puede atribuir a la actividad de la planta. Las plantas exudan hasta el 21% de su carbono fijado fotosintéticamente en la interfaz raíz-suelo26, alimentando a las comunidades microbianas e influyendo en su actividad y diversidad14. Berendsen, et al.27 sugirieron que las especies de plantas pueden seleccionar bacterias a través de la producción de exudados de raíces específicos y, por lo tanto, dar forma al microbioma de la planta. Utilizamos berenjenas injertadas sobre un portainjerto de tomate conocido por su alta capacidad de exudación (Solanum lycopersicum L. x Solanum habrochaites). Se estimó que la exudación de raíces en ambos medios de crecimiento era similar, porque las berenjenas cultivadas mostraron características de crecimiento y rendimiento comparables. Descubrimos que incluso después de seis meses, la comunidad microbiana en el medio de cultivo mineral (tanto en RW como en RWS) mostró una alta variabilidad a lo largo de los puntos de tiempo. Garbeva, et al.28 plantearon la hipótesis de que en un sistema estable, cada microhábitat está ocupado por organismos capaces de colonizar nichos. Un ecosistema diverso y estable a nivel de microhábitat resistirá el estrés ambiental29 y, potencialmente, la invasión de patógenos. Mendes, et al.14 sugirieron que la abundancia relativa de varios taxones bacterianos puede ser un indicador de la supresión de la enfermedad. De esta manera, el aumento de la resistencia a la invasión de patógenos puede estar relacionado con la biomasa microbiana total en el medio de cultivo, que compite con los patógenos por los recursos o puede causar inhibición a través del antagonismo directo15. Mendes, et al.14 identificaron Actinobacteria, γ- y β-Proteobacteria (Pseudomonadaceae, Burkholderiaceae, Xanthomonadales) y Firmicutes (Lactobacillaceae) como los taxones más dinámicos asociados con la supresión de enfermedades en suelo natural. En nuestro estudio, Rhodocyclaceae y Methylophilaceae (β-Proteobacteria), se correlacionaron con GB, así como otras α-, β y γ-Proteobacteria, como Hyphomicrobiaceae, Xanthobacteraceae, Phyllobacteriaceae y Chromatiaceae. Las actinobacterias como Gaiellaceae y Conexibacteraceae también se correlacionaron positivamente con GB. Además, la abundancia de Rhizobiaceae (como Agrobacterium sp.) se correlacionó negativamente con la abundancia de Methylophilaceae y Saprospiraceae en GB. Así, la abundancia relativa de varios taxones y la estabilidad de una comunidad microbiana pueden estar relacionadas con la resistencia contra invasores externos, apoyando la teoría de la supresión general. Aunque Agrobacterium sp. se detectó en ambos medios de cultivo (en promedio 7,6 × 103 CFU/ml en GB, 2,4 × 104 en RW y 1,0 × 106 CFU/ml en RWS, a través de los puntos de tiempo), las muestras de GB fueron negativas para la patogenicidad virC gene. Ni las UFC totales ni la presencia de taxones microbianos particulares se han asociado directamente con la resistencia a Agrobacterium rhizogenes27.

La planta, así como las complejas interacciones biológicas, químicas y físicas en el medio de cultivo, influyen en las comunidades microbianas de la rizosfera. Informes anteriores identificaron el pH como el principal impulsor de las comunidades microbianas en el suelo30. La humedad del suelo a menudo se asocia con el pH y puede haber afectado la composición de la comunidad entre GB, RW y RWS. Además, GB mostró abundancias relativas más altas de Actinobacteridae y α-Proteobacteria, que se han asociado con el pH del suelo de 30. La movilidad de las rizobacterias puede verse limitada por la humedad en el medio de cultivo, donde los poros llenos de agua pueden ser tan grandes como las células bacterianas31. Aunque Agrobacterium sp. se detectó en GB y RW, las raíces peludas no estaban visualmente presentes en GB. Nuestros resultados indican que las diferencias en el tamaño de los poros y la distribución del agua entre GB y RW pueden haber afectado la movilidad de Agrobacterium sp., lo que resultó en una disminución de la incidencia de la enfermedad. Se han observado altos rendimientos de raíces peludas que indican invasión de A. rhizogenes cuando la relación nitrato-amonio (NO3--N/NH4+) fue cercana a 5 con 115 mg NH4+-N/l de suelo y 553 mg NO3--N/l de suelo32. En nuestra prueba, la relación NO3−-N/NH4+-N fue de 2,3 para RWS, 31,9 para RW y 147,3 para GB. La baja concentración de amoníaco y el bajo pH en el medio GB pueden explicar la ausencia de raíces peludas33 y posiblemente moldearon la composición de la comunidad microbiana.

Nuestra metodología proporcionó una visión integral de las complejas interacciones bacterianas en los medios de cultivo hortícolas, lo que respalda nuestra hipótesis de que existen diferencias fundamentales entre las comunidades bacterianas asociadas con cada tipo de medio de cultivo hortícola. Las comunidades microbianas diversas y competitivas pueden proporcionar funcionalidades diferentes y únicas. Como consecuencia, la comunidad bacteriana que habita el medio GB puede haber proporcionado diversidad funcional y estabilidad temporal y resiliencia a este entorno heterogéneo y fluctuante. En última instancia, las interacciones en la comunidad residente también pueden desempeñar un papel en la resistencia a las fuerzas externas, como las especies invasoras que compiten en los sistemas de cultivo convencionales sin suelo. Las futuras estrategias de control alternativas pueden involucrar la evaluación de la supresión de los grupos microbianos y la transferencia de la supresión a suelos propicios con 0.1–10% de suelo supresor15. Las relaciones descritas también contribuirán a la comprensión de la ecología microbiana funcional asociada con los medios de cultivo y la interacción entre la comunidad microbiana y las plantas. El conocimiento sobre estas relaciones podría utilizarse potencialmente para desarrollar estrategias sostenibles para aumentar la productividad y la calidad de las plantas.

La comunidad microbiana asociada con los diferentes medios de cultivo fue monitoreada en un invernadero comercial de 8.5 ha en Holanda (51°59' Latitud y 4°10' Longitud), cultivando la berenjena Solanum melongena cultivar Jaylo (Rijk Zwaan, Holanda), injertada sobre Solanum lycopersicum L. x Solanum habrochaites Beaufort (De Ruiter, Países Bajos). Los dos medios de cultivo hortícolas diferentes se instalaron al mismo tiempo en el invernadero y las berenjenas de 48 días se plantaron encima de los dos medios de cultivo diferentes el mismo día. El medio de cultivo orgánico (GB, Grow Bag, Peltracom, Bélgica) fue una mezcla de turba blanca (H2-H4 en la escala de von Post34 [80 % v/v] y fibra de coco [20 % v/v]). Losas de GB y medio mineral (RW, Rock wool, Grotop expert, Grodan, Países Bajos) tenían las siguientes dimensiones: 1,0 m × 0,2 m × 0,085 m y 1,0 m × 0,2 m × 0,075 m, respectivamente. Ambos medios de cultivo se sometieron a tratamientos idénticos de agua y fertilizantes durante el período de cultivo según métodos estándar, con solución de fertirrigación estándar21. Se sembraron dos berenjenas por losa. Cada planta se entrenó a 3 tallos, con el objetivo de una densidad de plantas de 1,7 plantas/m2, lo que resultó en 5,1 tallos/m2.

El invernadero se dividió en varios bloques, cada uno de los cuales constaba de 6 filas en un diseño de bloques al azar. Se seleccionaron aleatoriamente dos bloques contiguos y cada bloque contenía medio RW o GB. Las dos filas exteriores de cada bloque no fueron seleccionadas debido a posibles interacciones con las filas adyacentes. Las berenjenas crecieron en placas colocadas consecutivamente con una interdistancia de 44 cm. Una losa se consideró como unidad experimental. Se seleccionaron al azar cinco placas de cada bloque de las 4 filas internas y de los dos medios de cultivo diferentes (GB y RW). Las muestras de las diferentes unidades experimentales se recolectaron en tres momentos durante la temporada de crecimiento (junio, julio y agosto) y al inicio del experimento. Se recolectaron, combinaron, homogeneizaron y trataron como una sola muestra diez submuestras de cada unidad experimental (Fig. 3 complementaria). En cada punto de tiempo, se tomaron muestras de 5 unidades experimentales fijas de cada RW y GB, incluido el material de la raíz. Cada muestra de 200 g se dividió en 4 submuestras homogéneas de 50 g para análisis posteriores: dos submuestras (submuestra 1 y 2) se usaron para análisis químicos, una submuestra (submuestra 3) se almacenó a 4 °C y se usó para aislamiento e identificación. de Agrobacterium sp. y las CFU totales, así como la determinación de la humedad y la submuestra 4 se almacenaron inmediatamente en hielo seco, se conservaron a -80 °C y se usaron para el análisis de la comunidad microbiana molecular. El productor informó de la presencia previa del síndrome de raíces peludas, que es causado por el patógeno Agrobacterium rhizogenes. Por lo tanto, se hizo un seguimiento de la incidencia de la enfermedad del síndrome de las raíces peludas mediante una inspección visual mensual del invernadero. El síndrome de raíces peludas se detectó en una losa de RW en el primer momento en junio. Una inspección visual adicional durante julio y agosto reveló una mayor incidencia del síndrome de las raíces peludas en el medio RW. Se tomaron muestras adicionales de RW de 5 losas adicionales que mostraban síntomas visuales del síndrome de raíces peludas (denominado RWS). Sin embargo, no se identificaron visualmente raíces peludas en el GB durante todo el período experimental (diciembre de 2012 y noviembre de 2013).

Se determinaron las características fisicoquímicas de los diferentes medios de cultivo al inicio (diciembre de 2012) y durante el ciclo vegetativo (junio, julio y agosto de 2013). El análisis químico se realizó según lo descrito por Gabriels, et al.35. La humedad (p/p-%) de los medios de cultivo se determinó según Verdonck y Gabriels36.

La curva de retención de agua del suelo de los medios RW y GB se estableció utilizando el aparato de caja de arena37 para potenciales de presión entre -1 y -10 kPa. Para este experimento, se usaron 10 réplicas de las muestras de losa. Se estimaron los parámetros de la ecuación de van Genuchten y se ajustaron los datos38.

El medio de crecimiento se analizó dentro de las 48 horas posteriores a la recolección de la muestra. Se mezclaron cinco gramos del medio de cultivo fresco con 45 ml de NaCl39 al 0,85 % y se homogeneizaron durante 2 minutos usando un mezclador Stomacher 80 (Stomacher, Seward, Worthing, Reino Unido). Esta suspensión se utilizó para la determinación de la célula total y Agrobacterium sp. contar con cada medio. Para el recuento total de células, la suspensión se sembró en agar R2A (Sigma Aldrich, Diegem, Bélgica) con cicloheximida (200 mg/l). Las colonias de agrobacterias se seleccionaron e identificaron siguiendo a Shams, et al.40. A. rhizogenes se aisló usando eritritol que contenía 2E-Te y 320 mg/l de K2TeO3 con cicloheximida. Después de 5 días de incubación a 28 °C, se contaron las unidades formadoras de colonias (CFU) para los medios R2A y 2E-TE. El cálculo de las UFC se hizo siguiendo los procedimientos descritos por Sutton41, donde el límite de detección fue igual a 1 UFC en la dilución más baja.

El ADN total se extrajo mediante disrupción física con el método de batido de cuentas de Hernandez-Sanabria, et al.42. Las células se lisaron en un homogeneizador FastPrep-96 (MP Biomedicals, Illkirch, Francia) y el ADN se precipitó con etanol frío y se resuspendió en 30 μl de tampón TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA [pH 8,0]). La concentración y la calidad del ADN se midieron en función de la absorbancia a 260 y 280 nm en un espectrofotómetro Nanodrop ND 1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, EE. UU.).

La presencia potencial de Agrobacterium sp. cepas fue analizada por PCR multiplex, dirigida al gen 23 S rRNA43. Se utilizaron cebadores directos universales UF y cuatro cebadores inversos específicos para A. tumefaciens (biovar 1), A. rhizogenes (biovar 2), A. vitis y A. rubi. Las condiciones de la PCR se describieron en otro lugar43; los pares de cebadores UF/B1R, UF/B2R, UF/AvR y UF/ArR se emplearon para amplificar fragmentos de 184, 1066, 478 y 1006 pb de longitud, respectivamente44. La detección del plásmido patógeno reveló la presencia del gen de patogenicidad virC ubicado en el plásmido rizogénico (Ri)45; Las condiciones de PCR para la detección del gen virC siguieron las de Kuzmanović, et al.44. Se realizó una confirmación adicional en aislados de tipo salvaje seleccionados al azar; La PCR de colonias se aplicó utilizando el protocolo descrito anteriormente.

Las amplificaciones por PCR de la región V3 (~200 pb) del gen 16 S rRNA de bacterias se realizaron con cebadores bacterianos universales como se describe por Øvreås, et al.46. Los productos de PCR se purificaron antes del análisis de huellas dactilares y la DGGE se ejecutó en tampón 1 × TAE (AppliChem, Darmstadt, Alemania) con un gel de poliacrilamida al 6 % con un gradiente de desnaturalización lineal del 30 al 50 %, utilizando el sistema universal de detección de mutaciones Bio-Rad DCode (BioRad, Hércules, CA, EE. UU.). Las condiciones de ejecución y el análisis utilizando el software BioNumerics, versión 5.1 (Applied Maths, Sint-Martens Latem, Bélgica) fueron informados por Hernandez-Sanabria, et al.42. Se crearon nuevas categorías de bandas que incluyen todos los filotipos bacterianos detectados en los medios de cultivo. La frecuencia de filotipos presentes exclusivamente en muestras con raíces pilosas se determinó adaptando la metodología de Hernández-Sanabria, et al.47, para realizar la prueba Fisher Exact en R48.

La región V5-V6 del gen 16 S rRNA se amplificó usando cebadores informados49. Las bibliotecas se prepararon agrupando proporciones equimolares de amplicones (200 ng de cada muestra), etiquetados con un código de barras único50. Las bibliotecas resultantes se secuenciaron en un MiSeq (Illumina, Hayward, CA, EE. UU.) emparejadas y unidas, pero solo se seleccionaron lecturas directas para el análisis final (140 nt). Se usó un programa de filtro de calidad que ejecuta una ventana deslizante del 10% de la longitud de lectura y calcula el puntaje promedio local basado en el puntaje de calidad de Phred del archivo FASTQ para recortar los extremos 3' de las lecturas que cayeron por debajo de una calidad puntuación de 10. Se descartaron lecturas con un carácter N en su secuencia, desajustes dentro de los cebadores y códigos de barras o más de 8 tramos de homopolímeros. Después del recorte de secuencias de cebadores, las secuencias se separaron en función de sus códigos de barras. Se generó una cantidad de filotipos representativos utilizando el algoritmo de Uclust en USEARCH51 mediante la agrupación en 97 % de similitud (1 desajuste), con un nivel de confianza de al menos 80, con los linajes de cianobacterias, eucariotas y arqueas eliminados. La base de datos filtrada contenía solo filotipos presentes en al menos a) una muestra con una abundancia superior al 1 %, b) en el 2 % de las muestras con una abundancia relativa superior al 0,1 % y 3) en el 5 % de las muestras con cualquier nivel de abundancia50. Por lo tanto, se obtuvieron un total de 475995 lecturas. La composición de la secuencia del conjunto de datos se comparó con la herramienta RDP Classifier52 y la base de datos SILVA53. Después de examinar los recuentos de lectura, los datos se enrarecieron aleatoriamente hasta una profundidad máxima elegida de 17135 secuencias, usando el paquete phyloseq de R54 y las curvas de rarefacción se trazaron usando el paquete vegano en R55. Las abundancias relativas de los doce taxones principales, con su clasificación RDP más profunda posible hasta el nivel de familia, se determinaron y trazaron como gráficos de barras56. Si alguna OTU no se clasificó hasta un nivel de familia, la secuencia de consenso se explotó utilizando la base de datos NCBI y se obtuvo la clasificación taxonómica. Dentro de cada muestra, se calcularon el número total de especies, la diversidad de Fisher, los índices de Shannon, Simpson y Simpson inverso para evaluar la diversidad alfa. El índice de Pielou se utilizó como indicador de uniformidad en la comunidad. Las diferencias en las medidas de diversidad alfa y uniformidad entre los medios de cultivo hortícolas se compararon utilizando un modelo mixto de medidas repetidas en SAS (versión 9.3, SAS Institute, Cary, EE. UU.), con el tipo de medio de cultivo como efecto fijo y comparando medias múltiples mediante la prueba de Tukey. Por lo tanto, las diferencias en las medidas de diversidad podrían atribuirse al punto de tiempo, al tipo de medio de crecimiento oa la interacción de tiempo*tipo de medio de cultivo. Se utilizaron los índices de Chao y Bray-Curtis para construir matrices de disimilitud de las comunidades. Por lo tanto, se determinó la diversidad beta de la comunidad y se empleó nMDS para visualizar las diferencias entre las muestras, utilizando el paquete vegano en R55. Se realizó un análisis de varianza multivariante permutacional estratificado (PERMANOVA) con 999 permutaciones para explorar el porcentaje de varianza que podría explicarse por las diferencias en la diversidad beta. Se aplicó ANOVA para descubrir si uno de los medios de cultivo era más variable que el otro55. Las diferencias en las abundancias relativas de las familias bacterianas se compararon utilizando un modelo mixto de medidas repetidas en SAS, con el ajuste lsmeans y la corrección de Bonferroni para comparaciones múltiples.

Las diferencias en las características fisicoquímicas de cada medio de cultivo hortícola se compararon utilizando un modelo mixto en SAS. Se utilizaron correlaciones de Pearson para determinar las interacciones entre las características fisicoquímicas y se asumió una significación de P < 0,05. Se incluyeron en el análisis dieciséis variables (humedad, pH, conductividad, nitrato-N, amonio-N, fósforo, potasio, calcio, magnesio, sulfato, sodio, cloruro, hierro, manganeso, UFC de A. rhizogenes sp. y bacterias totales ). Se empleó el análisis de factores múltiples (MFA) para detectar cómo las abundancias relativas de las familias contribuyeron a las diferencias entre los medios de crecimiento a lo largo de los puntos de tiempo. Además, se aplicó MFA a todo el conjunto de variables para evaluar las correlaciones entre las variables físicas, químicas y microbiológicas detectadas en ambos tipos de medio de cultivo. Cada grupo de variables se ponderó y los resultados se explicaron en un mapa de factores57, donde se graficó el valor de la abundancia de cada familia bacteriana (vector) para el medio de cultivo (factor) correspondiente. La función MFA del paquete FactoMineR58 se realizó en R. Las redes bipartitas se infirieron utilizando una matriz de similitud por pares obtenida del Análisis de correlación canónica regularizada59,60. Los valores de la matriz de similitud se calcularon como la correlación entre las abundancias relativas de las familias bacterianas y las características del medio de cultivo proyectadas en el espacio ocupado por los primeros componentes retenidos en el análisis. Se obtuvieron tres componentes relevantes fijando un umbral de r ≥ 0.5 y se diseminaron familias en la parcela, en estrecha relación con las variables correlacionadas y con el medio de cultivo donde fueron más abundantes. Se empleó un procedimiento de ordenación adicional, Análisis de Correspondencia (CA), para confirmar las relaciones entre familias bacterianas específicas y las características físicas y químicas evaluadas47.

Cómo citar este artículo: Grunert, O. et al. Los medios de cultivo minerales y orgánicos tienen una estructura comunitaria, estabilidad y funcionalidad distintas en los sistemas de cultivo sin suelo. ciencia Rep. 6, 18837; doi: 10.1038/srep18837 (2016).

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Este trabajo fue apoyado por la subvención del proyecto IWT Baekeland mandato 120200 y por la Fundación de Investigación de Flandes (Fonds Wetenschappelijk Onderzoek-Vlaanderen, FWO). Los autores agradecen a Guillaume Blanchet y Joris Meys por su apoyo estadístico. Agradecemos a Iris Plumeier, Silke Kahl por su asistencia técnica, Tim Lacoere por la obra de arte en la Fig. 3 complementaria y Frederiek-Maarten Kerckhof, Nicole Hahn, Ruben Props, Amanda K. Luther y Stephen J. Andersen por sus consejos.

Grunert Oliver y Hernandez-Sanabria Emma contribuyeron igualmente a este trabajo.

Laboratorio de Ecología y Tecnología Microbiana (LabMET), Universidad de Ghent, Coupure Links 653, Gent, B-9000, Bélgica

Oliver Grunert, Emma Hernandez-Sanabria, Ramiro Vilchez-Vargas & Nico Boon

Departamento de Producción Vegetal, Universidad de Ghent, Coupure Links 653, Gent, B-9000, Bélgica

Marie-Christine Van Labeke y Dirk Reheul

Peltracom NV, Skaldenstraat 7a, Gante, B-9042, Desteldonk, Bélgica

Oliver Grunert y Maaike Perneel

Departamento de Biología Molecular de Infecciones, Grupo de Investigación de Procesos e Interacciones Microbianas, Centro Helmholtz para la Investigación de Infecciones, Inhoffenstraße 7, Braunschweig, D-38124, Alemania

Ruy Jauregui & Dietmar H. Pieper

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Concibió y diseñó los experimentos: OG, EH-S., MCVL, DR y NB Realizó los experimentos: OG, EH-S. Procesamiento de bibliotecas Illumina: RJ y RV-V. Minería de datos, análisis estadístico, interpretación de resultados, elaboración de figuras y tablas: EH-S. y OG Aportaron reactivos/materiales/herramientas de análisis: NB, MP y DHP Redactaron el artículo: OG y EH-S.

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

Este trabajo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en la línea de crédito; si el material no está incluido bajo la licencia Creative Commons, los usuarios deberán obtener el permiso del titular de la licencia para reproducir el material. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

Reimpresiones y permisos

Grunert, O., Hernández-Sanabria, E., Vilchez-Vargas, R. et al. Los medios de cultivo minerales y orgánicos tienen una estructura comunitaria, estabilidad y funcionalidad distintas en los sistemas de cultivo sin suelo. Informe científico 6, 18837 (2016). https://doi.org/10.1038/srep18837

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Recibido: 19 junio 2015

Aceptado: 25 de noviembre de 2015

Publicado: 05 enero 2016

DOI: https://doi.org/10.1038/srep18837

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