Aplicación del gradiente de densidad para el aislamiento del componente fecal microbiano de las heces y su potencial uso

Scientific Reports volumen 5, Número de artículo: 16807 (2015) Citar este artículo

14k Accesos

34 citas

6 Altmetric

Detalles de métricas

La idea de considerar la microbiota intestinal como un órgano humano virtual ha llevado al concepto de trasplante de microbiota fecal (FMT), que recientemente ha tenido un gran éxito en el tratamiento de casos de infección recurrente por Clostridium difficile. La administración de microbiota fecal segura, viable y representativa es crucial para FMT. Hasta donde sabemos, no se han investigado a fondo las técnicas adecuadas y las condiciones sistemáticas para separar la microbiota fecal de las muestras de heces. En este trabajo mostramos el potencial para separar los microorganismos de las heces del resto de la materia fecal utilizando un procedimiento con un gradiente de densidad de Nycodenz®, arrojando 1010 bacterias viables por cada dos gramos de heces. Este procedimiento no afectó la composición de la microbiota original en términos de viabilidad, distribución y proporciones, según lo evaluado por un enfoque metagenómico filogenético. La obtención de la microbiota fecal por concentración y separación de los microorganismos del resto de componentes de las heces permitiría estandarizar su recuperación y su conservación a largo plazo. FMT o terapias de restauración de microbiota similares podrían usarse para el tratamiento de varios trastornos, o incluso con fines estéticos, por lo que el método descrito en nuestro trabajo puede contribuir a sentar las bases para el desarrollo de productos seguros y estandarizados.

El tracto gastrointestinal (GI) humano es un ecosistema complejo en el que la microbiota residente y los nutrientes interactúan continuamente con las células huésped1. La microbiota intestinal está compuesta por billones de bacterias, superando en un orden de magnitud a las células eucariotas de nuestro cuerpo2 y la idea de considerar a nuestra microbiota intestinal como un órgano virtual está ganando popularidad entre la comunidad científica3. Los genes aportados por nuestra microbiota intestinal se denominan 'microbioma intestinal', pero en ocasiones se utiliza como sinónimo el término 'microbioma humano' (teóricamente el complemento génico de todos los microbios que habitan en nuestro cuerpo)4. Con casi 10 000 000 de genes únicos, notablemente más que el "modesto" número de 21 000 genes humanos5,6, nuestra microbiota intestinal complementa los atributos metabólicos que están ausentes en nuestro organismo, incluida la capacidad de aprovechar nutrientes que de otro modo no serían metabolizables, la producción de ácidos grasos de cadena corta o vitaminas y muchos otros7. Por el contrario, el huésped humano proporciona nutrientes a la microbiota, es decir, nuestro IG es una especie de jardín microbiano donde cada individuo cultiva sus propios microbios beneficiosos.

Durante los últimos años, el gran avance de las tecnologías de secuenciación de alto rendimiento y su aplicación en el estudio de las comunidades microbianas intestinales está brindando evidencia creciente de que la microbiota intestinal tiene un impacto importante en la maduración exitosa de nuestro sistema inmunológico y en varias facetas del ser humano. fisiología, que puede incluir el desencadenamiento, la progresión y el establecimiento de varias enfermedades. Los perfiles de la microbiota intestinal no solo se ven afectados por la dieta8,9, la edad10 o la geografía11, sino que la alteración de nuestra composición de microorganismos intestinales se ha relacionado con algunos trastornos intestinales y autoinmunitarios como la obesidad12, el síndrome metabólico13, la artritis reumatoide14, la diabetes tipo 115, la inflamación intestinal enfermedades16 y lupus eritematoso sistémico (LES)17.

Si estamos de acuerdo en que la microbiota humana es uno más de nuestros órganos, rápidamente surgirá el concepto de trasplante de microbiota fecal (FMT). En la literatura científica, el FMT se describió por primera vez a finales de la década de 195018 y se puede definir como la "transferencia de heces procesadas de una persona sana al intestino de una persona enferma mediante enema, colonoscopia u otros medios"19. En particular, FMT tuvo una eficacia impresionante (más del 90 % de éxito en algunos casos) en el desplazamiento de la infección recurrente por Clostridium difficile del intestino de las personas afectadas que no respondían a la terapia con antibióticos y en el restablecimiento de una microbiota intestinal equilibrada20. Muy recientemente, FMT se aplicó con éxito para tratar la colitis inducida por antibióticos21. La generalización del FMT no regulado en ciertas poblaciones llevó a la Administración de Drogas y Alimentos de los EE. UU. (FDA) a regular estrictamente las heces como un fármaco biológico22.

Estas propiedades de FMT en la salud intestinal humana han tenido un alto impacto en la sociedad, incluyendo miles de entradas en conocidas redes sociales y blogs, así como la creación de fundaciones y otras organizaciones sin fines de lucro dedicadas a la promoción de la aplicación de FMT ( por ejemplo, http://thefecaltransplantfoundation.org/, http://thepowerofpoop.com/, http://www.openbiome.org/). La metodología actual para FMT incluye el procesamiento de heces frescas de donantes en el mismo día. Sin embargo, se han publicado algunos protocolos para separar la microbiota intestinal del resto de materia fecal mediante microfiltración, permitiendo por ejemplo su almacenamiento23. Siguiendo este protocolo, la microbiota intestinal se microfiltra primero en presencia de un crioprotector y luego se congela a -80 °C. Esta preparación microbiana ha demostrado ser tan eficaz como una preparación de heces frescas para el desplazamiento de Clostridium difficile, como lo demuestra el perfil del gen 16S rRNA24.

Las aplicaciones potenciales de FMT, además de las infecciones recurrentes por C. difficile, son numerosas pero merecen estudios sobre la normalización y estandarización de lo que es la microbiota fecal sana. En primer lugar, la extracción de la microbiota y su separación del resto del material fecal en condiciones controladas podría servir para evitar el carácter desagradable de las heces. En segundo lugar, esto podría permitir la conservación a largo plazo de la microbiota fecal, permitiendo su propagación en biorreactores, incluso muchos años después de su extracción. Además, facilitará tareas como el cribado de heces para virus (VIH, hepatitis y otros), parásitos y otros microorganismos indeseables.

En este trabajo, describimos la aplicación de un procedimiento de separación de microbiota fecal mediante el uso de un gradiente de densidad. Usando el perfil metagenómico de ADNr 16S, confirmamos que la estructura de la comunidad microbiana general permaneció inalterada después de ser separada de las heces. También se discuten las posibles aplicaciones de este método para la conservación a largo plazo de la microbiota intestinal.

La aprobación ética de este estudio se obtuvo en el marco del proyecto AGL2010–14952, del Ministerio de Economía y Competitividad de España ("Hacia una mejor comprensión de la funcionalidad de la microbiota intestinal en algunos trastornos inmunitarios"). Se obtuvo la aprobación final del Comité de Bioética del CSIC (Consejo Superior de Investigaciones Científicas) y del Comité Regional de Ética para la Investigación Clínica (Servicio de Salud del Principado de Asturias) en cumplimiento de la Declaración de Helsinki. Todas las determinaciones se realizaron con el consentimiento por escrito totalmente informado de todos los participantes involucrados en el estudio.

Las muestras de heces de este estudio se obtuvieron de cinco pacientes con lupus eritematoso sistémico (LES) y tres controles sanos, seleccionados de un estudio previo en el que se describía la disbiosis de la microbiota intestinal asociada con el LES17. Los datos clínicos y nutricionales detallados de esos participantes se pueden recuperar en el estudio mencionado anteriormente. Los pacientes con LES no utilizaron antibióticos, glucocorticoides, fármacos inmunosupresores, anticuerpos monoclonales u otras inmunoterapias durante los 6 meses previos a la recogida de la muestra.

Una parte de cada muestra de heces se sometió a un gradiente de densidad para separar la microbiota del resto de la materia fecal, según el método de Courtois y colaboradores con algunas modificaciones25. Se homogeneizaron dos gramos de heces en 18 ml de NaCl estéril al 0,9 % (p/v), en un mezclador de paletas de laboratorio (Stomacher Lab Blender 400, Seward Ltd. UK) durante 1 min. Se preparó una solución de Nycodenz® al 80 % (p/v) (PROGEN Biotechnik GmbH, Heidelberg, Dinamarca) en agua ultrapura y se esterilizó a 121 °C durante 15 min. Se colocó un volumen de 10,5 mL de la muestra fecal homogeneizada y diluida sobre 3,5 mL de la solución de Nycodenz® y se centrifugó durante 40 min a 4 °C (10 000 × g, rotor TST41.14, Kontron, Milán, Italia). La fase superior, que contenía restos solubles, se descartó después de la etapa de centrifugación y se recogieron las capas correspondientes a la microbiota extraída con 10,5 mL de PBS (Fig. 1). Las suspensiones celulares se mantuvieron en hielo durante 5 minutos para permitir la precipitación de los restos insolubles, luego se lavaron dos veces y se almacenaron en alícuotas de 1 mL, a -80 °C, hasta que se realizó la extracción de ADN. En todos los casos, se extrajo ADN directamente de muestras de heces homogeneizadas, o de las correspondientes fracciones de microbiota separadas, utilizando el kit QIAamp DNA Stool Mini (Qiagen Ltd., Strasse, Alemania), como se describe en un trabajo previo26.

Flujo de trabajo de la configuración experimental utilizada en este trabajo.

(A) Las muestras fecales homogeneizadas diluidas se cargaron encima de una solución de Nycodenz®, como se describe en la sección de materiales y métodos. (B) Después de la centrifugación, se formaron cuatro capas. El examen del contenido de la capa en un microscopio de contraste de fase nos permitió determinar la presencia de una capa, correspondiente a la microbiota fecal, entre dos capas que contenían restos fecales solubles (superior) e insolubles (inferior), todas por encima del Nycodenz. (C) Fotografía de luz de la capa de microbiota, que muestra una gran diversidad de tamaños y formas microbianas. Barra, 10 μm.

Para evaluar el rendimiento de la extracción de microbiota y establecer la viabilidad de la microbiota recuperada, se analizaron tres muestras fecales adicionales de tres donantes sanos mediante citometría de flujo antes y después de la extracción en gradiente de densidad. Para el recuento de bacterias, las muestras se midieron con un citómetro de flujo (Cytomics FC500, Beckman-Coulter Inc., Miami, Florida, EE. UU.) con el kit de recuento de bacterias (InvitrogenTM, Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Los valores absolutos de conteo en las muestras se determinaron tomando un mínimo de 2.000 y un máximo de 10.000 perlas estándar fluorescentes y según el análisis de las áreas correspondientes a las perlas: bacterias vivas (teñidas con Syto9) y bacterias muertas (teñidas con yoduro de propidio, Sigma, St. Louis, MO). La señal de activación se estableció en el detector de dispersión lateral (SSC) (según lo recomendado por el kit de recuento de bacterias, Invitrogen) y las señales de fluorescencia se recopilaron en el detector FL1 (510–550 nm) para Syto9 y el detector FL4 (660–700 nm) para propidio yoduro. Se utilizó PBS microfiltrado como control negativo. Además, como control de microbiota muerta, tratamos una alícuota de las muestras fecales a 98 °C durante 10 min más 15 min bajo exposición a luz ultravioleta. La viabilidad de la microbiota en cada muestra se calculó como el porcentaje de bacterias vivas dentro de la microbiota fecal antes y después del procedimiento de extracción con Nycodenz®. El número absoluto de bacterias se calculó utilizando las perlas fluorescentes como estándar interno en cada muestra, siguiendo las recomendaciones del proveedor para el recuento radiométrico. Las concentraciones relativas se expresaron como el número absoluto de bacterias en relación a los gramos de materia fecal seca total, que se determinó de acuerdo con los estándares FIL-IDF27,28.

Se obtuvieron amplicones del gen 16S rRNA parciales con los cebadores Probio_Uni y Probio_Rev (dirigidos a la región V3 y V4) por PCR como se describe en trabajos anteriores de nuestro grupo de investigación17,26. Se prepararon bibliotecas de secuencias con el kit Ion Sequencing 200 (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) a partir de los productos PCR purificados y se secuenciaron en un sistema Ion Torrent PGM en las instalaciones de GenProbio Ltd (http://www.genprobio. com). Después de la secuenciación, el software PGM eliminó los grupos específicos de lectura de secuencias, como las secuencias policlonales y de baja calidad. Las secuencias que coincidían con el adaptador PGM 3 'también se recortaron automáticamente. Todos los datos filtrados, recortados y aprobados por PGM se exportaron como archivos .sff.

Los archivos .sff fueron procesados ​​utilizando QIIME 1.7.0 con los scripts y procedimientos descritos en trabajos anteriores26,29. Solo las lecturas de secuencia con una longitud de entre 150 y 200 pb, así como con una puntuación de calidad de secuencia media superior a 25, se conservaron como parte del control de calidad. Las secuencias se recortaron en la primera base si se encontró una ventana móvil de 10 pb de baja calidad y se omitieron otras secuencias como homopolímeros (>7 pb) o secuencias con cebadores no coincidentes. Para calcular las medidas de diversidad aguas abajo (índices de diversidad alfa y beta, análisis Unifrac), se definieron unidades taxonómicas operativas (OTU) de 16S rRNA con una homología de secuencia ≥97 % y las secuencias quiméricas se eliminaron con Chimera Slayer30. Todas las lecturas se clasificaron en el rango taxonómico más bajo posible utilizando QIIME y un conjunto de datos de referencia de GreenGenes (versión 13.5, mayo de 2013, http://greengenes.secondgenome.com), pero, en general, el nivel familiar fue la unidad taxonómica más baja considerada a lo largo del estudio. . Las OTU se asignaron mediante uclust utilizando el script pick_de_novo_otus.py proporcionado con QIIME y exportado en formato BIOM para análisis posteriores31. Se calcularon diferentes métricas de diversidad alfa (Chao, especies observadas, Shannon y Simpson) a partir de las tablas formateadas de BIOM utilizando el script alpha_diversity.py proporcionado por QIIME.

Los perfiles del gen 16S rRNA antes o después de la extracción en gradiente de densidad se evaluaron en cuatro niveles taxonómicos (filo, clase, orden y familia). Las muestras se ordenaron de acuerdo con sus perfiles microbianos utilizando tres análisis multivariados diferentes y no supervisados, Análisis de Componentes Principales (PCA), Análisis de Coordenadas Principales (PCO) y Análisis de Correspondencia (CA), implementados en el software PAST v3.032. Después de realizar el pedido, las muestras se clasificaron según el tipo de muestra utilizada para la extracción de ADN (heces versus microbiota separadas en gradiente de densidad Nycodenz®). Se realizaron diferentes pruebas estadísticas sobre los datos multivariados, incluyendo ANOSIM unidireccional y PERMANOVA unidireccional, cada uno con 9.999 permutaciones. Para evaluar las diferencias en grupos taxonómicos individuales, las tablas OTU en formato BIOM se colapsaron en los cuatro niveles taxonómicos, se exportaron en formato de texto delimitado por tabulaciones y se analizaron con STAMP v2.0.333. La asociación de taxones con el tipo de muestra utilizado para la extracción de ADN se evaluó ejecutando pruebas de Welch bilaterales en cada par de medias. Finalmente se aplicó la corrección de False Discovery Rate34 y las diferencias significativas en los taxones entre las dos condiciones experimentales solo se consideraron por debajo de un valor de p de 0,05 y un valor de q por debajo de 0,2, como en trabajos anteriores17,35. Finalmente, se obtuvo una matriz de similitud mediante el índice de Jaccard para todas las muestras a nivel de familia utilizando PAST v3.0. Las similitudes entre las muestras se representaron en dendogramas construidos con el método Simple Linkage o con el algoritmo Neighbor Joining (utilizando 9999 repeticiones).

Durante los últimos años el creciente interés por comprender la composición de la microbiota intestinal humana ha llevado a un mayor conocimiento sobre cómo estas poblaciones microbianas pueden verse alteradas en el marco de determinadas enfermedades, en particular aquellas con componentes autoinmunes o inflamatorios. La microbiota intestinal empieza a ser considerada como un órgano dinámico del cuerpo humano y, como tal, susceptible de ser trasplantada con fines terapéuticos. En todas las vías y formas de administración de FMT reportadas, la materia fecal (fresca o congelada) se diluye en una solución salina o se liofiliza, generalmente en atmósferas no controladas.

La separación de microbios de las heces utilizando metodologías basadas en gradientes de densidad no es un concepto novedoso, ya que se ha utilizado para separar bacterias del suelo desde la década de 1970. Los primeros protocolos de separación consistían en pasos repetidos de mezcla y centrifugación en diferentes tampones y soluciones salinas36,37. Posteriormente se propuso la separación bacteriana por centrifugación en gradientes de sacarosa modificados38, o por paso a través de una resina de intercambio catiónico (Jacobsen y Rasmussen, 1992)39. La principal limitación de esos protocolos es que consumen mucho tiempo y, por lo tanto, son difíciles de implementar en los análisis de rutina; esta limitación se supera con Nycodenz resine25, aunque no se dan datos sobre la viabilidad bacteriana. En el marco de FMT, separar la microbiota GI del resto de la materia fecal ofrece la ventaja de reducir las preocupaciones higiénicas debido a la naturaleza poco atractiva de las heces.

En este trabajo se eligieron ocho muestras fecales de un trabajo de investigación previo que abordaba la disbiosis intestinal en el marco del LES17. Estas muestras fueron divergentes en cuanto a la diversidad bacteriana como se refleja en los diferentes valores de la relación Firmicutes a Bacteroidetes (FBR, menor en pacientes con LES con respecto a los controles sanos; HC4 = 8,6, HC32 = 8,8, HC33 = 4,5, SLE2 = 1,6, SLE12 = 1,0, SLE13 = 1,6, SLE21 = 1,2, SLE22 = 0,3). Curiosamente, se han observado cambios en FBR en ciertos trastornos humanos como la enfermedad de Crohn, la diabetes tipo 2 humana o la obesidad. El fundamento de esta elección fue evaluar si nuestro método de extracción podría interferir en muestras con diferentes FBR.

En nuestro enfoque, se cargó una dilución fecal homogeneizada sobre una solución de Nycodenz® al 80 % p/v (Fig. 1A) y se centrifugó a 10 000 × g. Esto difería del enfoque de Rooijers et al.40, que siguió la metodología de Murayama et al.41, con diferente preparación de gradiente de Nycodenz® y diferentes valores relativos de fuerza centrífuga. La microbiota se separó del resto de la materia fecal en un solo paso de centrifugación. Como puede verse en la Fig. 1B, se observaron dos capas correspondientes a la biomasa microbiana en la parte superior de la capa de desechos insolubles. Estos detritos facilitaron la tarea de recuperación de microorganismos una vez eliminada la fase superior de detritos solubles, ya que ofrecía una barrera física evitando la mezcla de la microbiota resuspendida con la capa inferior de Nycodenz®. Las diferentes capas se sometieron a microscopía de fase de contraste y la gran mayoría de los microorganismos se observaron en las dos capas mencionadas anteriormente (Fig. 1C).

El enfoque empleado para evaluar la eficiencia del procedimiento de extracción con Nycodenz® mostró que la viabilidad de la microbiota fecal separada con el gradiente de densidad se mantuvo en buena medida en comparación con la microbiota fecal fresca (Fig. 1 complementaria). En promedio, en la microbiota recuperada después del tratamiento con Nycodenz® el 66,9% de las bacterias seguían vivas, con valores que oscilaban entre el 71,3 y el 60,6% (66,9 ± 5,6) entre las tres muestras fecales analizadas, mientras que en heces frescas la viabilidad se estimó en rango entre 85,6-49,9% (68,6 ± 17,9). Esto da una idea de la buena eficiencia de la metodología propuesta para la concentración y aislamiento de microbiota viable, independientemente de la variación de las heces en términos de humedad y contenido de fibra. Las concentraciones de bacterias vivas en las tres muestras analizadas por citometría de flujo oscilaron entre 3,2 × 109 y 7,2 × 109 (5,2 ± 2,0 × 109) bacterias/gramo de materia seca fecal en las muestras originales de heces frescas y entre 5,7 × 109 y 9,0 × 109 (7,0 ± 1,8 × 109) por gramo de heces después de la extracción en gradiente de densidad. Esto significa que todas las bacterias viables se extraen de la materia fecal, con un rendimiento de alrededor de 1010 bacterias viables por dos gramos de muestra fecal. No se encontraron diferencias significativas en las concentraciones medias antes y después del tratamiento. Por lo tanto, nuestros resultados mostraron una variabilidad mínima en la microbiota viable recuperada entre diferentes donantes individuales y ningún impacto del protocolo de aislamiento sobre la integridad de las bacterias fecales.

El análisis de las fracciones de microbiota extraídas mediante el gradiente de densidad resultó en una disminución general de la diversidad en comparación con los resultados obtenidos a partir del ADN extraído directamente de las heces. Esto fue cierto cuando se calcularon los índices de diversidad alfa que tienen en cuenta solo la riqueza de especies (Chao 1, Especies observadas), pero se observó lo contrario cuando se utilizó el índice de Shannon, que tiene en cuenta la uniformidad de las especies (Shannon) (Fig. 2) . No se detectó ninguna diferencia en la diversidad alfa utilizando el índice de Simpson. En general, esto significa que aunque el número de OTU recuperadas es menor después de la extracción con Nycodenz®, las proporciones entre ellas no variaron necesariamente durante el proceso de extracción. Se debe tener cuidado en el sentido de que las reducciones en la diversidad alfa podrían afectar la eficacia de FMT, ya que podrían perderse grupos bacterianos precisos importantes para el equilibrio de la disbiosis. De esta manera, se necesita más investigación para determinar si la reducción de OTU/especies podría deberse en parte a la exposición al oxígeno durante la manipulación de la separación de la microbiota en el gradiente de densidad. Es posible que determinados tipos microbianos, más susceptibles al oxígeno, puedan protegerse si la extracción de la microbiota fecal se realiza en condiciones anaeróbicas estrictas. También será interesante dilucidar si los gradientes de Nycodenz® son útiles para eliminar selectivamente moléculas/microorganismos indeseables de las heces, como toxinas, priones y virus.

Diferentes índices de diversidad alfa obtenidos de las muestras de heces antes (gris oscuro) o después (gris claro) de la separación de la microbiota por gradiente de densidad.

Las barras representan la media ± desviación estándar. (*p < 0,05; ***p < 0,001).

Con el fin de saber si las diferencias observadas en diversidad microbiana entre las muestras, con o sin extracción con Nycodenz®, podrían ser utilizadas con fines de agrupamiento, las muestras se ordenaron utilizando la composición taxonómica a nivel de Phylum o Familia a través de diferentes metodologías: Análisis de Componentes Principales ( PCA), Análisis de Coordenadas Principales (PCoA) y Análisis de Correspondencia (CA) (Fig. 3). Cuando se utilizaron de forma imparcial, es decir, sin proporcionar información sobre el origen de los diferentes perfiles microbianos, todos los métodos de pedido pudieron agrupar las muestras en grupos separados (heces frente a microbiota extraída) (Fig. 3). La ausencia de efecto del método de extracción se sostuvo estadísticamente, a posteriori, con el uso de pruebas no paramétricas como One-way ANOSIM y One-way PERMANOVA. En ambos casos, las muestras se clasificaron primero según su origen y sus similitudes se midieron según distancias euclidianas. Los valores de p obtenidos no respaldaron la clasificación de las muestras en dos grupos (heces vs microbiota extraída; ANOSIM de una vía; valor de p 0,733; PERMANOVA de una vía; valor de p 0,353).

Se utilizaron diferentes metodologías de ordenamiento multivariante no sesgadas para determinar si las poblaciones microbianas obtenidas directamente de muestras de heces homogeneizadas (puntos negros) o de la microbiota fecal separada (cuadrados grises) se agruparon según su composición.

Las elipses representan la región estimada donde se esperaba que cayera el 95% de los puntos de población. Los análisis se realizaron a nivel de Filo y Familia. PCA: Análisis de Componentes Principales; PCoA, Análisis de Coordenadas Principales; CA, Análisis de Correspondencia.

Con el fin de estudiar más a fondo el efecto de la separación microbiana por gradiente de densidad en el perfil del gen 16S RNA, se construyó una matriz de similitud utilizando las abundancias familiares relativas mediante el cálculo de las distancias de Jaccard, un método ya utilizado en otros estudios metagenómicos42. Las muestras se agruparon utilizando aquellas distancias entre muestras según el método de enlace simple, o mediante el algoritmo de unión de vecinos y los correspondientes dendrogramas obtenidos (Fig. 4). En ambos casos, las muestras en las que se extrajo el ADN tras la separación de la microbiota, se agruparon con sus correspondientes muestras de heces, a excepción de las muestras LS12 y HD33. En estas muestras, el efecto de la extracción de microbiota sobre los perfiles metagenómicos fue mayor, y algunos grupos mostraron cambios drásticos a nivel de filo o familia (Supl. Fig. 2). Estos resultados confirmaron que, como regla general, las comunidades microbianas extraídas mediante el procedimiento de centrifugación en gradiente de densidad son representativas de las presentes en la muestra de heces original.

Dendogramas que muestran la similitud de las muestras según las distancias de Jaccard; (A) agrupamiento a través de un enlace simple; (B) agrupamiento mediante unión de vecinos con soporte de rama (10.000 repeticiones). Los sufijos NUEVO y VIEJO indican muestras donde la microbiota se extrajo o no en el gradiente de densidad, respectivamente, antes de la extracción de ADN.

Lindahl y Bakken43 introdujeron por primera vez la separación de microorganismos usando un gradiente de densidad Nicodenz® para el aislamiento de bacterias del suelo. Este método también se ha aplicado con éxito en otros sistemas biológicos, como en la descripción del metagenoma intestinal del picudo rojo de las palmeras (Rhynchophorus ferrugineus)44, o en la evaluación de la expresión génica en matrices lácteas45. Separar las bacterias de ciertos compuestos de la matriz puede ser muy útil para las aplicaciones de biología molecular posteriores, ya que este paso elimina muchos de los componentes que inhiben la PCR, como los compuestos húmicos o las sustancias coloreadas que interfieren con los protocolos de hibridación de transferencia46.

En nuestro trabajo se demostró que la aplicación de esta metodología no afectó la variabilidad global de la microbiota extraída y la diversidad de bacterias extraídas directamente del suelo o siguiendo el gradiente de Nycodenz® no fue significativamente diferente, a excepción de γ-Proteobacteria25. Sin embargo, algunos grupos taxonómicos mostraron variaciones significativas según el gradiente de extracción cuando se agruparon y analizaron la totalidad de las muestras (Cuadro 1). En general, los perfiles del gen 16S rRNA de muestras en las que se extrajo microbiota en el gradiente de Nycodenz® se caracterizaron por una mayor abundancia relativa del filo Firmicutes, debido a una mayor recuperación del orden Clostridiales (Supl. Fig. 3). Varios grupos de las divisiones Beta, Delta y Epsilon de los phyla Proteobacteria también mostraron variaciones significativas según el tratamiento, aunque en menor medida.

En general, la metodología presentada en este trabajo ofrece un método simple y directo para extraer y separar la microbiota fecal del resto de componentes de las heces, lo que permite mejoras adicionales como realizar este proceso en condiciones atmosféricas controladas. Además, este paso de extracción puede eliminar algunos compuestos indeseables de las heces, pero esto merece más investigación. Nuestro enfoque podría ser útil para obtener una microbiota intestinal representativa libre de material fecal para fines de almacenamiento a largo plazo. Esto también podría ser útil como primer paso para preservar las comunidades microbianas en general y usarse en un futuro cercano en el diseño de productos/vehículos basados ​​en microbiota para FMT y nuevas bioterapias de restauración intestinal. Sin embargo, se necesitan más mejoras de este método ya que, por ejemplo, algunas OTU relacionadas con Clostridium se vieron significativamente afectadas por la extracción con Nycodenz® y algunos miembros de este género, como C. scindens, pueden ser relevantes en el tratamiento de CDI47. Además, se necesitan experimentos con animales para demostrar que la microbiota extraída siguiendo este método se injerta efectivamente en el huésped.

Curiosamente, este protocolo se puede ampliar permitiendo el procesamiento de cantidades fecales más grandes con dispositivos centrífugos con mayor capacidad. Por ejemplo, se pueden procesar 430 gramos de materia fecal utilizando rotores oscilantes (hasta 30 000 × g) asignando 4 cubos de 1000 ml, con un rendimiento esperado de 1012 bacterias viables.

En resumen, la obtención de la microbiota representativa a partir de heces de un donante sano mediante el gradiente de densidad de Nycodenz® descrito en este trabajo permitiría concentrar la microbiota intestinal y mantenerla separada del resto de componentes de las heces, manteniendo altos niveles de viabilidad. Por un lado, Nycodenz® es una molécula segura, en términos de toxicidad humana, que puede eliminarse fácilmente de las muestras en el proceso de extracción de microbiota. Con respecto a otras moléculas utilizadas para el aislamiento de gradientes de densidad, el compuesto denso de rayos X Nycodenz® muestra ventajas, como un efecto no inhibidor sobre la actividad de la mayoría de las enzimas, compatibilidad con los ensayos de determinación de proteínas y, lo que es relevante para el propósito. de este trabajo, muestra una baja toxicidad en seres humanos41. Por otro lado, el gradiente de densidad permite la recuperación de microbiota fecal representativa y viable y la supresión de microorganismos/compuestos no deseables, además de facilitar el análisis de las muestras para detectar agentes peligrosos. Esto podría permitir el desarrollo de aplicaciones posteriores, como estrategias terapéuticas basadas en la microbiota para la restauración intestinal microbiana, tanto en el marco de una enfermedad determinada como para otras aplicaciones.

Cómo citar este artículo: Hevia, A. et al. Aplicación del gradiente de densidad para el aislamiento del componente fecal microbiano de las heces y el uso potencial del mismo. ciencia Rep. 5, 16807; doi: 10.1038/srep16807 (2015).

Backhed, F., Ley, RE, Sonnenburg, JL, Peterson, DA & Gordon, JI Mutualismo huésped-bacteriano en el intestino humano. Ciencia 307, 1915–1920 (2005).

Artículo ANUNCIOS Google Académico

Gill, SR et al. Análisis metagenomático del microbioma del intestino distal del humano. Ciencia 312, 1355–1359 (2006).

Artículo CAS ANUNCIOS Google Académico

Evans, JM, Morris, LS & Marchesi, JR El microbioma intestinal: el papel de un órgano virtual en la endocrinología del huésped. Revista de Endocrinología 218, R37–R47 (2013).

Artículo CAS Google Académico

Weinstock, GM Enfoques genómicos para estudiar la microbiota humana. Naturaleza 489, 250–256 (2012).

Artículo CAS ANUNCIOS Google Académico

Li, JH et al. Un catálogo integrado de genes de referencia en el microbioma intestinal humano. Naturaleza Biotecnología 32, 834–841 (2014).

Artículo CAS Google Académico

Qin, JJ et al. Un catálogo de genes microbianos del intestino humano establecido por secuenciación metagenómica. Naturaleza 464, 59–70 (2010).

Artículo CAS Google Académico

Brestoff, JR & Artis, D. Bacterias comensales en la interfaz del metabolismo del huésped y el sistema inmunológico. Inmunología de la naturaleza 14, 676–684 (2013).

Artículo CAS Google Académico

Arumugam, M. et al. Enterotipos del microbioma intestinal humano. Naturaleza 473, 174–180 (2011).

Artículo CAS Google Académico

Wu, GD et al. Vinculación de patrones dietéticos a largo plazo con enterotipos microbianos intestinales. Ciencia 334, 105–108 (2011).

Artículo CAS ANUNCIOS Google Académico

Claesson, MJ et al. La composición de la microbiota intestinal se correlaciona con la dieta y la salud en los ancianos. Naturaleza 488, 178–184 (2012).

Artículo CAS ANUNCIOS Google Académico

Yatsunenko, T. et al. Microbioma intestinal humano visto a través de la edad y la geografía. Naturaleza 486, 222–227 (2012).

Artículo CAS ANUNCIOS Google Académico

Turnbaugh, PJ et al. Un microbioma intestinal asociado a la obesidad con una mayor capacidad de recolección de energía. Naturaleza 444, 1027–1031 (2006).

Artículo ANUNCIOS Google Académico

Vijay-Kumar, M. et al. Síndrome metabólico y microbiota intestinal alterada en ratones que carecen del receptor tipo Toll 5. Science 328, 228–231 (2010).

Artículo CAS ANUNCIOS Google Académico

Scher, JU & Abramson, SB El microbioma y la artritis reumatoide. Nature Reviews Rheumatology 7, 569–578 (2011).

Artículo CAS Google Académico

Wen, L. et al. Inmunidad innata y microbiota intestinal en el desarrollo de diabetes tipo 1. Naturaleza 455, 1109–1110 (2008).

Artículo CAS ANUNCIOS Google Académico

Manichanh, C., Borruel, N., Casellas, F. & Guarner, F. The gut microbiota in IBD. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology 9, 599–608 (2012).

Artículo CAS Google Académico

Hevia, A. et al. Disbiosis intestinal asociada a lupus eritematoso sistémico. mBio 5, e01548–14 (2014).

Artículo CAS Google Académico

Eiseman, B., Silen, W., Bascom, GS y Kauvar, AJ Enema fecal como complemento en el tratamiento de la enterocolitis pseudomembranosa. Cirugía 44, 854–859 (1958).

CAS PubMed Google Académico

Smith, MB, Kelly, C. & Alm, EJ Cómo regular los trasplantes fecales. Naturaleza 506, 290–291 (2014).

Artículo Google Académico

van Nood, E. et al. Infusión duodenal de heces de donante para Clostridium difficile recurrente. New England Journal of Medicine 368, 407–415 (2013).

Artículo CAS Google Académico

Satokari, R. et al. Tratamiento de trasplante fecal de colitis no infecciosa inducida por antibióticos y seguimiento de microbiota a largo plazo. Reportes de Casos en Medicina 2014, 913867 (2014).

Artículo Google Académico

Fox, JL Trasplantes fecales para seguir las normas de la FDA. Naturaleza Biotecnología 31, 583–583 (2013).

Artículo CAS Google Académico

Hamilton, MJ, Weingarden, AR, Sadowsky, MJ y Khoruts, A. Preparación congelada estandarizada para el trasplante de microbiota fecal para la infección recurrente por Clostridium difficile. Revista estadounidense de gastroenterología 107, 761–767 (2012).

Artículo Google Académico

Hamilton, MJ, Weingarden, AR, Unno, T., Khoruts, A. y Sadowsky, MJ El análisis de secuencias de ADN de alto rendimiento revela un injerto estable de la microbiota intestinal después del trasplante de bacterias fecales previamente congeladas. Microbios intestinales 4, 125–135, (2013).

Artículo Google Académico

Courtois, S. et al. Cuantificación de subgrupos bacterianos en suelo: comparación de ADN extraído directamente del suelo o de células previamente liberadas por centrifugación en gradiente de densidad. Microbiología ambiental 3, 431–439 (2001).

Artículo CAS Google Académico

Milani, C. et al. Evaluación de la microbiota fecal: un protocolo de análisis basado en el gen rRNA 16S Torrent de iones optimizado. Plos One 8, e68739 (2013).

Artículo CAS ANUNCIOS Google Académico

FIL (Federación Internacional de Productos Lácteos). Queso y producto de queso procesado. Determinación del contenido de sólidos totales. Método de referencia. Norma FIL-IDF 4A:1982. Federación Internacional de Lechería, Bruselas, Bélgica (1982).

FIL (Federación Internacional de Productos Lácteos). Leche, nata y leche evaporada - Determinación del contenido de sólidos totales. Método de referencia. Norma FIL-IDF 21B:1987. Federación Internacional de Lechería, Bruselas, Bélgica (1987).

Caporaso, JG et al. QIIME permite el análisis de datos de secuenciación comunitaria de alto rendimiento. Métodos de la naturaleza 7, 335–336 (2010).

Artículo CAS Google Académico

Haas, BJ et al. Formación y detección de secuencias de ARNr quimérico 16S en amplicones de PCR pirosecuenciados con Sanger y 454. Investigación del genoma 21, 494–504 (2011).

Artículo CAS Google Académico

McDonald DCJ, Kuczynski, J., Rideout, JR, Stombaugh, J., Wendel, D., Wilke, A., Huse, S., Hufnagle, J., Meyer, F., Knight, R. y Caporaso, JG El formato de la Matriz de Observación Biológica (BIOM) o: cómo aprendí a dejar de preocuparme y amar el ome-ome. Gigaciencia 1, 7 (2012).

Artículo Google Académico

Hammer, Ø., Harper, DAT & Ryan, PD PASADO: Paquete de software de estadísticas paleontológicas para educación y análisis de datos. Paleontología Electrónica 4, 4 (2001).

Google Académico

Parks, DH & Beiko, RG Identificación de diferencias biológicamente relevantes entre comunidades metagenómicas. Bioinformática 26, 715–721 (2010).

Artículo CAS Google Académico

Benjamini, Y. & Hochberg, Y. Controlando la tasa de descubrimiento falso: un enfoque práctico y poderoso para las pruebas múltiples. Revista de la Royal Statistical Society Serie B-Metodológica 57, 289–300 (1995).

MathSciNet MATEMÁTICAS Google Académico

Morgan, XC et al. Disfunción del microbioma intestinal en la enfermedad inflamatoria intestinal y su tratamiento. Biología del genoma 13, R79 (2012).

Artículo CAS Google Académico

Faegri, A., Torsvik, VL & Goksoyr, J. Actividades bacterianas y fúngicas en el suelo: separación de bacterias y hongos mediante una técnica de centrifugación fraccionada rápida. Biología y bioquímica del suelo 9, 105–112 (1977).

Artículo Google Académico

Torsvik, VL Aislamiento de ADN bacteriano del suelo. Biología y bioquímica del suelo 10, 15–21 (1980).

Artículo Google Académico

Pillai, SD, Josephson, KL, Bailey, RL, Gerba, CP y Pepper, IL Método rápido para el procesamiento de muestras de suelo para la amplificación por reacción en cadena de la polimerasa de secuencias genéticas específicas. Microbiología aplicada y ambiental 57, 2283–2286 (1991).

CAS PubMed PubMed Central Google Académico

Jacobsen, CS & Rasmussen, OF Desarrollo y aplicación de un nuevo método para extraer ADN bacteriano del suelo basado en la separación de bacterias del suelo con resina de intercambio catiónico. Microbiología aplicada y ambiental 58, 2458–2462 (1992).

CAS PubMed PubMed Central Google Académico

Rooijers, K. et al. Un flujo de trabajo iterativo para extraer el metaproteoma intestinal humano. BMC Genomics 12, 6 (2011).

Artículo CAS Google Académico

Murayama, K., Fujimura, T., Morita, M. & Shindo, N. Fraccionamiento subcelular de tejido hepático de rata en un solo paso usando un gradiente de densidad de Nycodenz preparado por congelación-descongelación y perfiles bidimensionales de electroforesis de dodecilsulfato de sodio de los principales fracción de orgánulos. Electroforesis 22, 2872–2880 (2001).

3.0.CO;2-D" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F1522-2683%28200108%2922%3A14%3C2872%3A%3AAID-ELPS2872%3E3.0.CO%3B2-D" aria-label="Article reference 41" data-doi="10.1002/1522-2683(200108)22:143.0.CO;2-D">Artículo CAS Google Académico

Fe, JJ et al. La estabilidad a largo plazo de la microbiota intestinal humana. Ciencia 341, 1237439 (2013).

Artículo Google Académico

Lindahl, V. & Bakken, LR Evaluación de métodos para la extracción de bacterias del suelo. Fems Microbiology Ecology 16, 135–142 (1995).

Artículo CAS Google Académico

Jia, SG et al. Metagenomas intestinales estacionalmente variables del picudo rojo de las palmeras (Rhynchophorus ferrugineus). Microbiología ambiental 15, 3020–3029 (2013).

CAS PubMed PubMed Central Google Académico

Makhzami, S. et al. Expresión génica in situ en matrices de queso: aplicación a un conjunto de genes enterocócicos. Revista de Métodos Microbiológicos 75, 485–490 (2008).

Artículo CAS Google Académico

Schneegurt, MAD, Sophia, Y., Kulpa & Charles, F. Jr. Extracción directa de ADN de suelos para estudios en ecología microbiana. actual Cuestiones Mol. Biol. 5, 1–8 (2003).

CAS PubMed Google Académico

Buffie, CG et al. La reconstitución precisa del microbioma restaura la resistencia mediada por ácidos biliares a Clostridium difficile. Naturaleza 517, 205–207 (2015).

Artículo CAS ANUNCIOS Google Académico

Descargar referencias

Esta investigación ha sido financiada por las Becas AGL2010-14952, AGL2013-44039-R, AGL2013-44761-P y BIO2014-55019-JIN del "Plan Estatal de I+D+I" español y por la Beca EM2014/046 del "Plan galego de investigacion, innovacion y crecimiento 2011-2015". Borja Sánchez y Arancha Hevia recibieron un contrato postdoctoral Ramón y Cajal y una beca FPI, respectivamente, del Ministerio de Economía y Competitividad de España.

Departamento de Microbiología y Bioquímica de Productos Lácteos, Instituto de Investigaciones Lácteas (IPLA-CSIC), Paseo Río Linares s/n, 33300 Villaviciosa, Asturias, España

Arancha Hevia, Susana Delgado, Abelardo Margolles & Borja Sánchez

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

AM y BS concibió la investigación. AH, SD y BS realizaron los experimentos y escribieron el texto principal del manuscrito. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

Este trabajo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en la línea de crédito; si el material no está incluido bajo la licencia Creative Commons, los usuarios deberán obtener el permiso del titular de la licencia para reproducir el material. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

Reimpresiones y permisos

Hevia, A., Delgado, S., Margolles, A. et al. Aplicación del gradiente de densidad para el aislamiento del componente fecal microbiano de las heces y el uso potencial del mismo. Informe científico 5, 16807 (2015). https://doi.org/10.1038/srep16807

Descargar cita

Recibido: 01 Abril 2015

Aceptado: 20 de octubre de 2015

Publicado: 19 noviembre 2015

DOI: https://doi.org/10.1038/srep16807

Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenido Springer Nature SharedIt

Cirugía de Obesidad (2023)

Comunicaciones ISME (2022)

Informes científicos (2021)

Informes científicos (2020)

Comunicaciones de la naturaleza (2018)

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y Pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.