Extrusión mecanosensible de Enterovirus A71

Nature Microbiology volumen 8, páginas 629–639 (2023)Citar este artículo

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El enterovirus A71 provoca una enfermedad grave tras una infección sistémica, que a veces conduce a una disfunción neurológica potencialmente mortal. Sin embargo, en la mayoría de los casos, la infección es asintomática y se limita al tracto gastrointestinal, donde el virus se amplifica para la transmisión. Se ha demostrado previamente que los picornavirus salen de las células infectadas a través de la lisis celular o la secreción de vesículas. Aquí informamos que las células enteras infectadas con Enterovirus A71 se extruyen específicamente de la superficie apical de organoides de colon humano diferenciados, como se observa mediante microscopía confocal. La sensibilidad diferencial a los inhibidores químicos y peptídicos demostró que la extrusión de células infectadas por virus depende de la detección de fuerza a través de canales iónicos mecanosensibles en lugar de la muerte celular apoptótica. Cuando se aíslan y se utilizan como inóculo, las células extruidas intactas que contienen virus pueden iniciar nuevas infecciones. Por el contrario, cuando se inhibe la detección de fuerza mecánica, se liberan grandes cantidades de virus libres. Por lo tanto, es probable que la extrusión de células vivas infectadas por virus del tejido epitelial intacto beneficie tanto la integridad de los tejidos del huésped como la propagación protegida de este patógeno fecal-oral dentro y entre los huéspedes.

La cuestión de cómo los virus de la progenie abandonan una célula o tejido infectado es vital para nuestra comprensión de la propagación viral en un huésped infectado y entre huéspedes. Durante décadas, se pensó que los picornavirus, como virus sin envoltura o 'desnudos', se transmitían de forma estrictamente lítica, a través de la ruptura dramática de la célula infectada. La liberación lítica de picornavirus de líneas celulares de cultivo tisular estándar da como resultado una dispersión generalizada de viriones para iniciar rondas posteriores de infección. Sin embargo, se ha demostrado la propagación no lítica de varios picornavirus, durante los cuales los virus se apropian de las membranas intracelulares para facilitar su liberación de células intactas, envueltas dentro de vesículas extracelulares1,2,3,4. Una consecuencia de esta estrategia de transmisión es que, en lugar de la propagación dispersiva de partículas virales individuales, los virus se transmiten en bloque dentro de paquetes membranosos5.

Los modelos de organoides epiteliales son herramientas interesantes para examinar las respuestas específicas de tejido a las agresiones patogénicas6,7. Los organoides esféricos 3D derivados de células madre adultas se pueden diferenciar para recapitular la diversidad de tipos de células presentes en los tejidos nativos8. Los organoides normalmente crecen con sus superficies apicales orientadas hacia los compartimentos luminales interiores. Las monocapas u organoides polarizados en 2D que se cortaron mecánicamente para permitir el acceso apical del Enterovirus A71 (EV-A71) se han utilizado para modelar la infección por EV-A71 del epitelio gastrointestinal9,10,11. Recientemente, se han desarrollado métodos para invertir la topología de los organoides para presentar la superficie apical del epitelio gastrointestinal a los patógenos entéricos directamente mientras se preserva la integridad epitelial12,13. En este artículo, estos organoides apicales se utilizan para monitorear la infección de células epiteliales por EV-A71 y los mecanismos posteriores de propagación viral en este tejido.

Estábamos interesados ​​en utilizar organoides epiteliales gastrointestinales apicales como modelo de infección por EV-A71 en el que se mantiene la integridad de la barrera epitelial. Elegimos utilizar organoides derivados del tejido colónico (colonoides), debido a la proximidad del colon a la salida viral de un huésped infectado, para comprender mejor la transmisión de EV-A71. Los colonoides derivados del tejido de la cripta humana adulta se cultivaron en andamios de membrana basal en presencia de factores de tallo, incluidos WNT y R-spondin, generando esferoides de células madre con su superficie basolateral hacia afuera y sus superficies apicales lumenales hacia adentro. Cinco días antes de la infección, se extrajeron los colonoides del andamiaje de la membrana basal y se mantuvieron en cultivo en suspensión en ausencia de matriz para inducir la inversión de la topología del organoide de modo que las superficies apicales estuvieran en el exterior del organoide (apical hacia afuera)12. Al mismo tiempo, se aplicó medio para inducir la diferenciación celular. En estos colonoides humanos apicales, monitoreamos la organización del citoesqueleto de actina y el receptor SCARB2 de EV-A71 (Fig. 1a). La superficie apical de los colonoides bien diferenciados y polarizados contiene microvellosidades con borde en cepillo, que son fácilmente identificables con la tinción de actina F como una capa gruesa rica en actina. SCARB2 es una proteína integral de la membrana lisosomal que cicla hacia la superficie apical de las monocapas polarizadas14,15 y se expresó abundantemente en estos colonoides apicales (Fig. 1a).

a, Organoides epiteliales de colon diferenciados apical hacia fuera expresan el receptor EV-A71 SCARB2 (rojo), localizándose en las membranas intracelulares. La integridad del borde en cepillo de microvellosidades de actina apical (blanco) es visible. b, Los organoides de colon se infectaron con EV-A71. Los títulos virales se controlaron a lo largo del tiempo mediante un ensayo de placa. Se muestran los datos de cuatro experimentos independientes que utilizan dos donantes de colonoides diferentes. c, las células infectadas con EV-A71 se observaron mediante un ensayo de inmunofluorescencia después de la tinción para ARNv de doble cadena después de 48 h de infección. Derecha: aumento aumentado de la célula infectada indicado por una punta de flecha amarilla en el panel izquierdo. Barras de escala, 10 μm.

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Las curvas de crecimiento viral que comenzaron inmediatamente después de la infección mostraron que EV-A71 podría infectar productivamente colonoides apical-out diferenciados de dos donantes humanos diferentes, y la acumulación de virus en el cultivo continuó hasta 48 h después de la infección (Fig. 1b). En ese momento, los colonoides infectados se fijaron, tiñeron y examinaron mediante microscopía confocal para detectar la presencia de ARN viral de doble cadena (ARNv), que es evidente en las células infectadas después de la fijación, para identificar complejos de replicación de ARNv. Se observaron fácilmente patrones de tinción citoplasmática y yuxtanuclear punteada indicativos de complejos de replicación de ARNv (Fig. 1c). Curiosamente, la mayoría de las células infectadas estaban solitarias entre sus vecinas no infectadas.

La falta de propagación viral observable, incluso cuando el rendimiento viral aumentaba, podría racionalizarse luego de una inspección cuidadosa de las superficies apicales de los colonoides infectados. Nos sorprendió la observación frecuente de células infectadas por virus que parecían estar saliendo de colonoides intactos (Fig. 2a-c). En el epitelio gastrointestinal sano, la extrusión de células enteras mantiene el número de células homeostáticas al facilitar la eliminación de las células existentes para igualar la tasa de expansión de las células madre en las criptas. De hecho, se extruyen tantas células que la vida útil promedio de una célula epitelial gastrointestinal es de solo 2 a 5 días16,17. Para determinar si las frecuencias a las que la extrusión de células infectadas con EV-A71 excedieron las de las células no infectadas, cuantificamos la frecuencia con la que las células infectadas y no infectadas sufrieron extrusión de los mismos colonoides infectados con EV-A71 (Fig. 2d, e y Tabla complementaria 1 ). Los colonoides infectados se fijaron, tiñeron y examinaron mediante microscopía confocal. Las células individuales se clasificaron como (1) infectadas o no infectadas y (2) con extrusión o sin extrusión. Una célula se definió como extruida de un organoide si su núcleo había cruzado el borde apical del organoide, visualizado al teñir la actina cortical con faloidina. En el punto de tiempo de 48 h examinado, el 40% de las células infectadas estaban extruyendo, en comparación con solo el 1% de las células no infectadas (Fig. 2d y Tabla complementaria 1). De manera similar, aunque las células infectadas constituían solo el 0,4% de las células dentro de los organoides, constituían el 25% de las células extruidas (Fig. 2e y Tabla complementaria 1). Estos datos demuestran que las células infectadas se expulsan de los colonoides a frecuencias significativamente más altas de lo esperado por azar.

a–c, los colonoides infectados se fijaron 48 h después de la infección y se tiñeron para detectar ARNv de doble cadena. d, las células infectadas se extruyeron de los colonoides con mayor frecuencia que las células no infectadas. Los porcentajes de células infectadas o no infectadas que salen de un organoide individual se muestran como círculos pequeños. La proporción de células que se extruyen en todos los organoides en cada experimento se muestra como triángulos del mismo color que los colonoides individuales. Se cuantificaron al menos diez organoides por experimento: **P < 0,01; Prueba t pareada de dos colas, N = 3 experimentos. e, Los porcentajes de células extruidas y no extruidas infectadas se midieron de manera similar. De las células que estaban extruyendo, un mayor porcentaje estaba infectado. **P < 0,01; medidas repetidas ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Tukey, N = 3 experimentos. En d y e, los números de células sin procesar representados en los gráficos se muestran en la Tabla complementaria 1. f, los colonoides infectados con EV-A71 se tiñeron para la expresión de Muc2, un marcador para las células caliciformes. La punta de flecha indica una célula infectada. La flecha indica la celda caliciforme que se muestra en g. g, célula caliciforme que expresa Muc2. h,i, la expresión de Villin identifica los colonocitos. Villin se localiza apicalmente, superponiéndose con el borde en cepillo de las microvellosidades ricas en actina. Se muestran distintas células individuales. j, k, los colonoides infectados con EV-A71 se tiñeron para determinar la expresión de Villin. l, se muestran células infectadas en extrusión representativas. m, Se representan las etapas de extrusión de células canónicas en epitelios no infectados. n,o, Se observaron células infectadas con poliovirus Tipo 1 (Mahoney) saliendo de los organoides del íleon mediante inmunofluorescencia. o muestra una celda individual resaltada en n. Barras de escala, 10 μm. En d y e, las barras horizontales y de error representan la media ± sd

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Para identificar el tipo de célula permisiva en los colonoides, realizamos inmunotinción con anticuerpos dirigidos a Villin1 y Muc2, expresados ​​por colonocitos absorbentes y células caliciformes, respectivamente (Fig. 2f-k). Ambos tipos de células se han implicado previamente en la infección por EV-A71 en el epitelio gastrointestinal10,11. Nuestras observaciones sugieren que los colonocitos absorbentes, en lugar de las células caliciformes, fueron el tipo de célula principalmente infectado en este modelo. Este hallazgo no excluye la infección de las células caliciformes en el epitelio en el que las células caliciformes son más abundantes.

Observamos células infectadas en varios estados distintos que recuerdan las etapas de extrusión canónica de células completas (Fig. 2l, m). La extrusión celular es un proceso altamente coordinado que permite la eliminación de células indeseables manteniendo la integridad de la barrera epitelial18,19. Durante la extrusión canónica, las células destinadas a la extrusión y sus células vecinas reorganizan sus citoesqueletos para rodear la base de las células extruidas; estos anillos de actina-miosina se contraen apicalmente para exprimir las células que están siendo expulsadas por lo que se ha denominado un mecanismo de "falta de dinero" (Fig. 2n)20. Al mismo tiempo, se vuelven a formar uniones estrechas entre las nuevas células vecinas debajo de las células extruidas para mantener la integridad epitelial21,22. El desplazamiento celular y la formación de nuevos vecinos ocurren durante un período de aproximadamente 40 min. Las células extruidas se adhieren al epitelio durante 40 minutos adicionales antes de separarse de sus vecinos y alejarse flotando20,23. Observamos células infectadas en estados consistentes con las etapas temprana y tardía de extrusión, como se muestra en la Fig. 2l. A la izquierda, se puede ver una célula infectada incrustada dentro de un organoide, rodeada por una capa de actina que se condensa debajo de la célula infectada. La imagen central muestra una célula extruida todavía en contacto con una superficie apical intacta reformada. Se observó que la célula infectada completamente separada de la derecha flotaba en suspensión junto a los organoides infectados.

Para investigar si el fenómeno de la extrusión de células infectadas era específico de EV-A71, examinamos células infectadas con poliovirus, un miembro de la especie relacionada Enterovirus C. En los organoides derivados del tejido ileal del intestino delgado, así como del tejido colónico, se observaron fácilmente células infectadas por poliovirus en extrusión (Fig. 2n,o y Datos ampliados Fig. 1). Sugerimos que varios enterovirus provocan la expulsión de células infectadas de organoides gastrointestinales por extrusión de células enteras. Además, cuestionamos si la extrusión de células infectadas con EV-A71 era específica de la arquitectura epitelial de los organoides apicales. Sin embargo, la extrusión de células infectadas se observó fácilmente en los colonoides basolaterales contrastantes (Datos ampliados, Fig. 2).

Para caracterizar el momento de la extrusión de células infectadas, visualizamos las células infectadas dentro de los colonoides durante la primera ronda de infección (Datos extendidos Fig. 3 y Tabla complementaria 2). Observamos que las células infectadas pueden extruirse tan pronto como 5 h y tan tarde como 9 h después de la infección, y que las células infectadas extruidas en todos los puntos de tiempo contenían abundante ARNv. Por lo tanto, las diferencias de célula a célula en la cinética de infección24 probablemente contribuyan al momento de la extrusión. El número de células infectadas en los colonoides aumentó significativamente de 5 h a 7 h después de la infección, pero luego se redujo sustancialmente, aunque la cantidad de virus infeccioso en todo el cultivo siguió aumentando (Fig. 1b). Que las células infectadas se eliminen predominantemente entre 7 y 9 h después de la infección es consistente con la falta de transmisión de célula a célula observada dentro de los colonoides.

La extrusión de células apoptóticas del epitelio intacto se describió originalmente como un medio para eliminar las células moribundas sin comprometer la barrera epitelial20. Dado que la infección por EV-A71 puede desencadenar la apoptosis en varios tipos de células25,26,27,28, probamos si la señalización apoptótica desencadena la extrusión de células infectadas en los colonoides. Utilizamos un sustrato fluorogénico (CellEvent, ThermoFisher) para visualizar células que expresaban caspasas activas 3 y 7. Los organoides infectados se incubaron con sustrato, se fijaron, se tiñeron para ARN de doble cadena y se examinaron mediante microscopía confocal (Fig. 3a-e). Aproximadamente la mitad de las células extruidas no infectadas fueron caspasa 3/7 positivas, lo que concuerda con el funcionamiento normal de la extrusión celular en el epitelio intestinal29. Sin embargo, una fracción significativamente menor de células extruidas infectadas fue positiva para caspasa 3/7 (Fig. 3f y Tabla complementaria 3). Además, los núcleos de las células infectadas que se extruyen normalmente estaban intactos y no mostraban los núcleos condensados ​​y fragmentados característicos de las células apoptóticas. Estos datos argumentan que el estrés apoptótico no provoca la extrusión de células infectadas.

Los colonoides infectados se visualizaron mediante microscopía confocal de inmunofluorescencia después de 48 h de infección. La actividad de las caspasas 3 y 7 se visualizó usando un sustrato fluorogénico. a, organoides infectados individuales con células de extrusión. b, aumento aumentado de una sola célula extruida apoptótica no infectada en a. c, aumento aumentado de dos células extruidas no apoptóticas infectadas en a. d, organoides infectados individuales con células de extrusión. e, Ampliación de dos celdas de extrusión en d. f, Se cuantificaron las proporciones de células de extrusión infectadas y células de extrusión no infectadas que estaban apoptóticas, y los valores generales para cada experimento se muestran como triángulos. Cada color representa un experimento independiente, con medidas para cada organoide individual que se muestran como pequeños círculos. *P < 0,05; prueba t pareada de dos colas, N = 3; las barras horizontales y de error representan la media ± sd Los números de celda sin procesar representados en este gráfico se muestran en la Tabla complementaria 3. Barras de escala, 10 µm.

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Además de la muerte celular por apoptosis o piroptosis, la extrusión de células del epitelio gastrointestinal puede desencadenarse por fuerzas mecánicas sobre las células debido al hacinamiento30,31. Aunque no desempeña ningún papel en la extrusión de células apoptóticas, el canal iónico mecanosensible Piezo1 detecta y responde al estrés por aglomeración celular, lo que desencadena la extrusión celular29. Presumimos que la alteración de las propiedades biomecánicas de las células infectadas puede ser detectada por Piezo1, lo que lleva a la extrusión dependiente de la fuerza de las células infectadas. Para probar esta hipótesis, tratamos los colonoides infectados con GsMTx4, un péptido del veneno de araña que inhibe la actividad de los canales iónicos mecanosensibles, incluido Piezo1 (refs. 32, 33). También evaluamos el efecto de Z-VAD-FMK, un inhibidor de pan-caspasa conocido por reducir la extrusión de células apoptóticas23. Finalmente, dado que el reordenamiento de actina-miosina es crítico para la extrusión celular independientemente del desencadenante inicial, probamos el efecto del inhibidor de miosina II para-nitro-Blebbistatin34 como control positivo para la inhibición de todos los mecanismos de extrusión celular35,36 (Fig. 4e ).

Organoides infectados con EV-A71 fueron expuestos a compuestos capaces de inhibir factores celulares implicados en diferentes mecanismos de extrusión. a–d, los organoides infectados se expusieron a un control de vehículo DMSO al 0,5 % (a), para-nitro-blebbistatina 50 μM (b), Z-VAD-FMK 100 μM (c) o GsMTx4 20 μM (d). Las células infectadas en los organoides se inspeccionaron visualmente mediante microscopía confocal. Las puntas de flecha amarillas indican células infectadas en organoides representativos. Barras de escala, 10 μm. e, la blebbistatina inhibe tanto la extrusión apoptótica como la mecanosensible, Z-VAD-FMK inhibe solo la extrusión apoptótica y GsMTx4 inhibe solo la extrusión mecanosensible. f, se enumeró el porcentaje de células infectadas que experimentaron extrusión después de 7 h de infección. Cada color muestra un experimento independiente. La proporción general de células infectadas que se extruyen por experimento se muestra como triángulos, y las medidas para cada organoide se muestran como círculos pequeños. **P < 0,01; NS, no significativo; ANOVA unidireccional de medidas repetidas con la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett, N = 3. g, Los títulos virales cuantificados a las 7 h después de la infección de cultivos de organoides en suspensión infectados no muestran efectos significativos de los tratamientos farmacológicos en el rendimiento del virus. Medidas repetidas ANOVA unidireccional con la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett, N = 3 infecciones independientes. En f y g, las barras horizontales y de error representan la media ± sd

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Después de 2 h de infección con EV-A71, los colonoides se trataron con los compuestos anteriores durante el resto de un solo ciclo de infección (Fig. 4a-d). La proporción de células infectadas que sobresalen de los colonoides se cuantificó en cada condición (Fig. 4f). Como era de esperar, el porcentaje de células infectadas que se extruían de los organoides se redujo en presencia de blebbistatina y no se vio afectado por Z-VAD-FMK, que inhibe solo la extrusión apoptótica. Sin embargo, observamos una reducción sorprendente en el porcentaje de células infectadas que experimentan extrusión en presencia del inhibidor del canal iónico mecanosensible GsMTx4 (Fig. 4f). Para excluir la posibilidad de que esto se deba a la inhibición del crecimiento viral, evaluamos el efecto de todos los compuestos sobre el rendimiento viral, ninguno de los cuales cambió (Fig. 4g). Estos resultados argumentan que es la actividad de detección de fuerza de los canales iónicos mecanosensibles a los que se dirige GsMTx4 lo que es crucial para la eliminación de células vivas infectadas con EV-A71.

Para determinar si las células infectadas extruidas podrían proporcionar una fuente de propagación viral dentro del tracto gastrointestinal, las células extruidas (Células) se recolectaron mediante sedimentación diferencial (Métodos) y se determinó la cantidad de virus dentro de ellas. Para confirmar que los pasos de lavado eliminaron eficazmente el virus libre de células de la fracción de células, se añadieron 106 unidades formadoras de placa de virus exógeno a un conjunto de muestras (Células + Medio). El virus enriquecido aumentó considerablemente el título viral en las muestras de Cells + Media (Fig. 5b). Sin embargo, el título viral en las Células no se modificó por la adición de virus exógeno, lo que demuestra que los lavados eliminaron con éxito el potencial virus libre de contaminantes. Además, como se muestra en la Fig. 5c, hubo significativamente más virus infecciosos en las fracciones de Células extruidas que en los Medios sin células.

a, los cultivos de colonoides infectados con EV-A71 se recolectaron 8 h después de la infección y los componentes se recolectaron mediante sedimentación diferencial. b, Para evaluar la eficacia del lavado de las células extruidas, se añadieron 106 UFP de virus libre exógeno a las muestras de Células + Medio. Las fracciones que incluían pozo completo (barras en blanco), células + medio (barras de puntos pequeños) y células (barras de puntos grandes) se sometieron a un ensayo de congelación-descongelación y placa. ANOVA unidireccional de medidas repetidas con la prueba de comparaciones múltiples de Holm-Šídák. NS, no significativo. c, Distribución de virus en Células y en Medios. Prueba t de relación pareada de dos colas. d, Estabilidad del virus de fracciones de Células y Medios. Las fracciones recolectadas se incubaron a 37 °C durante los tiempos indicados, se sometieron a congelación-descongelación repetitiva y posterior ensayo de placas. Las cantidades de virus se normalizan a valores de c antes de la incubación. ANOVA bidireccional con corrección Geisser-Greenhouse. e, se usaron fracciones de Células extruidas intactas y virus libres del lavado final de Células para infectar monocapas de células RD. Los títulos virales en las células RD infectadas se midieron 1 h y 16 h después de iniciar la infección secundaria. Proporción pareada (células-células; lavado-lavado) y no pareada (lavado-células), pruebas t de dos colas. La línea discontinua indica el límite de detección. f, se usaron fracciones de células y virus libres del lavado final de células para infectar nuevos colonoides. Después de 2 hy 16 h, se determinó la cantidad de virus en las fracciones de pocillos completos mediante un ensayo de placas. Pruebas estadísticas como se describe en e. g, h, microscopía confocal de células RD infectadas secundariamente (g) y organoides inoculados con células después de 16 h (h). Barras de escala, 10 μm. h, Organoide infectado secundariamente con varias células infectadas. Abajo: sección transversal ortogonal a través de la célula extruida secundariamente infectada indicada por una punta de flecha amarilla. i, los cultivos de colonoides infectados con EV-A71 se trataron con GsMTx4 o vehículo, y las fracciones se recogieron después de 8 h. Mientras que el tratamiento con GsMTx4 redujo la cantidad de virus infeccioso en las células extruidas, aumentó la cantidad de virus infeccioso libre en los medios. Pruebas t de dos colas y pares múltiples con la corrección de Holm-Šídák para comparaciones múltiples. En b – f e i, se muestra un experimento representativo con infecciones independientes realizadas por triplicado; *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001; los datos representados son la media ± sd

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Para determinar cuánto tiempo permanecieron vivas las células extruidas después de la extrusión, monitoreamos el estado apoptótico de las células después de 48 h. En ese momento, la mayoría de las células extruidas, tanto infectadas como no infectadas, eran caspasa 3/7 positivas (datos extendidos, figura 4), lo que sugiere que las células extruidas como resultado de una infección viral eventualmente sufren muerte celular apoptótica inducida por desprendimiento. Para probar si la residencia dentro de estas células moribundas extruidas dañó los viriones residentes, las preparaciones de células y medios que se muestran en la Fig. 5c se incubaron a 37 °C. Todas las muestras se sometieron a congelación y descongelación repetitivas para lisar las células antes del ensayo de placas. Durante un curso de tiempo de 48 h, el virus que residía dentro de las Células retuvo la estabilidad de la misma manera que el virus libre en los Medios (Fig. 5d). Por lo tanto, las células infectadas expulsadas del epitelio colónico contienen virus infecciosos estables.

Para dilucidar si las células extruidas son infecciosas, se prepararon fracciones de células a partir de colonoides infectados y se usaron como inóculos para infecciones secundarias (Fig. 5e, f). El crecimiento viral tanto en monocapas de células de rabdomiosarcoma (RD) infectadas secundariamente como en colonoides previamente no infectados se examinó comparando los títulos inmediatamente después de la infección y después de 16 h de infección. Como control para el aislamiento efectivo de las células de cualquier virus libre restante, también se usaron como inóculos los sobrenadantes del último de los tres lavados. En cultivos infectados con células extruidas de organoides previamente infectados, había abundante virus inmediatamente después de la infección (Fig. 5e,f) y se observaron aumentos significativos tras la incubación. Es importante destacar que, después de 16 h, la cantidad de virus en cultivos infectados con células extruidas fue significativamente mayor que en cultivos infectados con sobrenadante de lavado, lo que indica que la presencia de células extruidas, en lugar de virus residual sin células, fue responsable de las altas cargas virales. . La microscopía confocal confirmó la presencia de células infectadas dentro de monocapas y colonoides RD infectados secundariamente (Fig. 5g, h). Por lo tanto, las células extruidas que contienen virus son infecciosas tanto para las monocapas de RD como para los colonoides diferenciados apicales.

Para determinar el destino de los virus y las células retenidas en la capa epitelial del colonoide cuando se inhibía la extrusión, los colonoides se infectaron con EV-A71 y se recolectaron fracciones de pozo completo, organoide, células y medios (Fig. 5a) mediante sedimentación diferencial (Métodos, Datos extendidos Fig. 5 y Tabla complementaria 4). Las muestras se congelaron y descongelaron repetidamente para liberar el virus intracelular antes del ensayo de placas. Como se esperaba, la inhibición de la detección de fuerza por el tratamiento con GsMTx4 no afectó el crecimiento viral general, como lo demuestra la fracción Whole Well, aunque se encontró significativamente menos virus en la fracción de células extruidas. La cantidad de virus infeccioso dentro de los organoides intactos no aumentó con el tratamiento con GsMTx4, aunque se bloqueó la liberación de células infectadas. En cambio, se observó una cantidad significativamente mayor de virus en la fracción de medios cuando se bloqueó la extrusión (Fig. 5i). Suponemos que la extrusión de células de la capa epitelial evita el resultado que ocurriría de otro modo: la liberación de virus libres de células.

Las células infectadas experimentan una variedad de tensiones metabólicas, oxidativas y de mal plegamiento que desencadenan respuestas celulares innatas como la apoptosis, la autofagia y la síntesis de mediadores inflamatorios. Los virus exitosos inhiben o subvierten muchas de estas respuestas para mejorar la replicación viral. Aquí informamos que EV-A71 también afecta las vías de señalización mecanosensoriales. En las células polarizadas de organoides de colon, las células infectadas con EV-A71 se extruyen preferentemente en el medio extracelular apical que corresponde a la luz del colon. Este proceso podría ser ventajoso tanto para el huésped, al eliminar las células infectadas del epitelio intestinal, como para la población viral, cuya extrusión colectiva probablemente facilite la transmisión entre huéspedes. En ratones infectados con EV-A71, se ha observado previamente un acortamiento de las vellosidades intestinales37,38. El acortamiento de las vellosidades en otros contextos patológicos resulta del aumento de las tasas de pérdida celular por extrusión39. Por lo tanto, la expulsión mecanosensible de células infectadas de organoides es consistente con estas observaciones in vivo y puede explicarlas.

En este trabajo, demostramos que la extrusión de enterocitos infectados con EV-A71 de colonoides humanos polarizados se ve obstaculizada por el pequeño péptido GsMTx4, un inhibidor de los canales iónicos mecanosensibles33. Estos datos implican la detección de fuerza como desencadenante de la extrusión de células infectadas. En monocapas polarizadas cultivadas y epitelios intestinales, se sabe que el canal iónico sensible a la fuerza Piezo1 actúa como un sensor para la homeostasis de la densidad celular29,40. Cuando los epitelios están superpoblados, Piezo1 induce la extrusión de células vivas no apoptóticas hasta que se restablece el número de células homeostáticas29. Las piezoproteínas son homotrímeros incrustados en la membrana plasmática, con brazos en forma de hélice y un poro central permeable al Ca+241. Tras la deformación de la membrana plasmática por la fuerza mecánica, se cree que los brazos se reposicionan, induciendo un cambio conformacional en el que se abre el poro41. Postulamos que Piezo1 es un candidato probable para la extrusión impulsada por la fuerza de las células infectadas que se informa aquí.

En este estudio, observamos que las células infectadas que sobresalen de los colonoides humanos estaban redondeadas y habían perdido las microvellosidades de actina en sus superficies apicales. Por el contrario, las células infectadas dentro de los colonoides parecían similares en tamaño y forma a las vecinas no infectadas. Se sabe que los enterovirus provocan una reorganización global de los componentes de la célula huésped, incluidos todos los elementos del citoesqueleto42,43,44. De hecho, los reordenamientos drásticos del citoesqueleto son los principales contribuyentes a la descripción utilizada con frecuencia del "efecto citopático" causado por muchos virus45. La reducción tanto de la tensión de la membrana como del anclaje del citoesqueleto se han implicado en la activación de Piezo141,46,47. Es probable que las alteraciones del citoesqueleto inducidas por la infección viral cambien las propiedades biomecánicas de las células infectadas con EV-A71, lo que conduce a la activación de Piezo1 y la posterior extrusión (datos ampliados, figura 6).

La eliminación de células infectadas por competencia celular mecánica podría beneficiar al huésped al limitar la propagación viral local en el tejido infectado. Además, cuando se bloqueó la extrusión, se observó un aumento de virus extracelular, lo que sugiere que las células infectadas obligadas a permanecer dentro de los organoides liberan virus al medio a través de lisis o secreción no convencional. Si las células infectadas están al borde de la lisis, su extrusión podría beneficiar al huésped al mantener la barrera epitelial, reducir la inflamación o ambas cosas (Fig. 6).

Las células infectadas con EV-A71 expulsadas del colon a la luz gastrointestinal pueden desempeñar un papel integral en la transmisión fecal-oral. Cuando se extruyen células portadoras de virus infecciosos, se espera que los viriones de la progenie transiten por el intestino y se excreten en las heces dentro de las células vivas extruidas. Dentro de las células, los viriones pueden protegerse del contenido intestinal, como los anticuerpos de las mucosas. La agrupación de viriones dentro de la célula también podría facilitar la transmisión en bloque, lo que permitiría mantener la diversidad genómica viral. El potencial de los beneficios para el huésped de la extrusión de células infectadas in vivo, como una eliminación viral más rápida o una mejor tolerancia a la infección, sigue siendo una pregunta abierta e intrigante para estudios adicionales.

Las células extruidas también podrían servir como un medio para la propagación viral desde una región del tejido gastrointestinal a una región más distal en el mismo huésped oa otro huésped (Fig. 6). Descubrimos que las propias células infectadas con EV-A71 son infecciosas tanto para las monocapas celulares como para los organoides previamente no infectados. El tránsito a través del colon dentro de una célula extruida podría proteger a los viriones del contenido luminal, como los anticuerpos de la mucosa (Fig. 6). Tal entrega viral en bloque puede tener varias consecuencias, debido a la transmisión de virus concentrados y al mantenimiento de la complejidad de la población de cuasiespecies virales intracelulares5,48,49,50.

Nuestros hallazgos se suman a un creciente cuerpo de evidencia de que los patógenos intracelulares pueden eliminarse de las capas epiteliales a través de la eyección controlada de células infectadas a través de una variedad de mecanismos. Rotavirus, reovirus, virus respiratorio sincitial y Salmonella desencadenan la muerte celular piroptótica o apoptótica en células individuales infectadas que posteriormente se extruyen31,51,52,53,54. Por el contrario, Listeria y el virus del sarampión inducen una eliminación masiva, con decenas de células infectadas vivas que forman grandes montículos que se agregan sobre epitelios polarizados36,55,56. El fenómeno único de la extrusión de una sola célula dependiente de la fuerza de las células infectadas descrito aquí puede acompañar a la infección con patógenos intracelulares adicionales que quedan por identificar.

En resumen, estos hallazgos identifican el fenómeno de la extrusión viva de células infectadas por virus iniciada por la actividad del canal iónico mecanosensible. La extrusión mecanosensible puede cumplir una función inmune innata crucial al iniciar la expulsión de células infectadas del tejido epitelial. Además, dado que las células extruidas pueden iniciar una infección viral adicional, la eliminación de células infectadas por el virus puede servir como un medio de transmisión fecal-oral que antes no se había apreciado.

Los organoides se generaron siguiendo los principios descritos en la ref. 8. Los organoides epiteliales gastrointestinales fueron generados previamente por el laboratorio de Calvin Kuo en la Universidad de Stanford13, a través de la disección de biopsias de tejido gastrointestinal humano adulto sano. Estos fueron anonimizados y obtenidos por el Banco de Tejidos de Stanford con el consentimiento del paciente y la aprobación de la junta de revisión institucional de la Universidad de Stanford. Las biopsias de tejido se adquirieron sin recopilar específicamente información del paciente sobre la edad y el sexo, y no se realizó una inscripción específica o planificada en particular (https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2211124719301457?via%3Dihub).

Para el mantenimiento, los organoides se sembraron dentro de la matriz de membrana basal del factor de crecimiento reducido Cultrex, tipo II (BME, equivalente a Matrigel) en gotitas dentro de una placa tratada con cultivo de tejidos de 24 pocillos (40 µl por pocillo). BME se polimerizó mediante incubación durante 10 min a 37 °C, luego se superpuso medio de crecimiento encima de BME. El medio de cultivo consta de medio Eagle modificado de Dulbecco avanzado (DMEM)/F12, HEPES 1 mM, 1 × Glutamax, 1 × B27 (sin vitamina A), N-acetil-cisteína 1 mM (solo para muestras intestinales y colónicas), 10 nM gastrina, factor de crecimiento epidérmico 50 ng ml−1, nicotinamida 10 mM, A83-01 500 nM, SB202190 10 µM, FGF10 100 ng ml−1 (solo para muestras gástricas) y medio acondicionado con L-WRN al 50 % (contiene Wnt3a, R-spondin 3 y Noggin). El medio acondicionado con L-WRN se preparó a partir de células L-WRN57. El medio acondicionado con L-WRN se dividió en alícuotas y se congeló a -80 °C para el almacenamiento a largo plazo sin que se observaran efectos negativos en el crecimiento de los organoides. El medio de crecimiento se reemplazó cada 1 a 4 días según fuera necesario.

Para el paso, los organoides se disociaron en células individuales en TrypLE Express durante 10 a 15 min a 37 ° C, se interrumpieron manualmente mediante pipeteo y luego se inactivó la tripsina con FBS. En hielo, las células se filtraron a través de un filtro de células de malla de nailon de 70 µm de poro para eliminar grandes grupos de células u organoides no disociados. Las células se contaron en un contador de células Countess II (ThermoFisher) y se resembraron en BME a una concentración de 5 × 103 a 1,5 × 104 células por pocillo. Durante 2 a 3 días después del pase inicial, se incluyeron Y27623 10 µM y CHIR99021 250 nM en medio de crecimiento para evitar la muerte celular mediada por desprendimiento. Los organoides se pasaron cada 4 a 10 días según fuera necesario. Todos los organoides utilizados se probaron con Myco-Sniff (MP Biomedicals) para garantizar que no hubiera contaminación por micoplasma.

Después de 4 a 7 días de crecimiento, los organoides se retiraron de Matrigel y se les indujo a revertir su polaridad para exponer la superficie apical12. Los organoides se incubaron en EDTA 5 mM en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 4 °C durante 40 min, se lavaron con DMEM y se resuspendieron en medio de diferenciación: Advanced DMEM/F12, 1 mM HEPES, 1x Glutamax, 1x B27, N-acetil-cisteína 1 mM (solo para muestras intestinales y colónicas), gastrina 10 nM, factor de crecimiento epidérmico 50 ng ml−1, Noggin 10 ng ml−1, A83-01 500 nM, inhibidor de la γ-secretasa IX 5 µM ( también conocido como DAPT, solo muestras de colon), 100 ng ml−1 FGF10 (solo para muestras gástricas) y 10 µM Y27623. Los organoides en cultivo en suspensión se sembraron en placas o matraces de unión ultrabaja (Corning Costar) y se incubaron a 37 °C durante 5 días para completar la diferenciación y la inversión de polaridad antes del uso experimental.

Las células RD, un regalo del laboratorio de Peter Sarnow, se cultivaron en DMEM (Hyclone; 4500 mg l-1 de glucosa, l-glutamina 4 mM y piruvato de sodio 1 mM) suplementado con suero fetal bovino al 10 % (Omega Life Sciences), 1x aminoácidos no esenciales (MEM NEAA, Gibco) y 1x penicilina-estreptomicina (Gibco). Las células RD se cultivaron a 37 °C con 5 % de CO2. Las células HeLa se cultivaron en DMEM (Hyclone; 4500 mg l-1 de glucosa, l-glutamina 4 mM y piruvato de sodio 1 mM) suplementado con suero bovino fetal al 10 % (Omega Life Sciences) y penicilina-estreptomicina 1x (Gibco). Ni las células RD ni las HeLa están en la lista de líneas celulares mal identificadas que mantiene el Comité Internacional de Autenticación de Líneas Celulares (https://iclac.org/databases/cross-contaminations/). La información sobre la autenticación de líneas celulares se puede encontrar en Información complementaria.

La cepa EV-A71 Taiwan/4643/98 se amplificó a partir de un clon infeccioso producido por el laboratorio de Jen-Ren Wang utilizando células RD58. La secuencia de ADN complementaria completa de la cepa de virus utilizada se puede encontrar con el número de acceso de GenBank JN544418. Se generaron reservas de virus del segundo pase viral en células RD y se utilizaron para infecciones. El título viral se determinó mediante un ensayo de placas en células RD, utilizando una superposición de agarosa al 0,3 % (p/v); las placas se fijaron después de 3 días con formaldehído al 2% y se enumeraron mediante tinción con cristal violeta. El poliovirus tipo 1 Mahoney se amplificó a partir de un clon infeccioso y se amplificó en células HeLa. El título viral se determinó mediante un ensayo de placas en células HeLa, utilizando una superposición de avicel al 1,2 % (p/v); las placas se fijaron y tiñeron de manera similar para la enumeración después de 2 días.

Se infectaron organoides apicalmente diferenciados (5 días después de la diferenciación y la inversión de la polaridad) con la cepa 4643 de EV-A71. Dado que las células RD son muy susceptibles a la infección por EV-A71, la multiplicidad de infecciones definida por las células RD corresponde a una infección mucho más escasa. en organoides. Por lo tanto, los organoides se expusieron a una alta multiplicidad de infecciones (MOI, 620 UFP por célula) para establecer una infección en la que se infectaron cinco o menos células por organoide. Se prepararon organoides apicales a partir de tejidos colónicos, gástricos y duodenales y se infectaron con EV-A71. Entre estos tres tejidos, los colonoides fueron los más fuertemente infectados (Fig. 1b y Datos extendidos Fig. 7).

Para separar los organoides en suspensión de los desechos antes de la infección, los organoides se recogieron en un tubo cónico de 15 ml y se dejaron sedimentar por gravedad en la mesa de trabajo (1 g) durante 5 a 10 min. Se descartó el sobrenadante y los organoides sedimentados se lavaron una vez en DMEM. La granulación por gravedad dio como resultado una contaminación muy baja con células individuales (Datos extendidos Fig. 5 y Tabla complementaria 4). Se extrajo una alícuota de esta suspensión de organoide, se disoció con TrypLE Express y se contó con Countess II Cell Counter (ThermoFisher) para enumerar las células en suspensión de organoide para los cálculos de MOI. Para los experimentos en los que se realizaron infecciones por triplicado, la suspensión de organoide se dividió en tres tubos cónicos. Los organoides se sedimentaron a 300 g durante 3 min y se resuspendieron en un volumen adecuado de stock de virus (3,7 × 108 PFU ml−1), se transfirieron a una placa de fijación ultrabaja y se incubaron a 37 °C con CO2 al 5 % durante 2 h. Después de la incubación, los organoides se lavaron tres veces en DMEM con centrifugaciones a 300 g durante 3 min. Después del tercer lavado, los organoides se resuspendieron en medio de diferenciación tibio y se sembraron en placas de cultivo de tejidos de unión ultrabaja. Luego se agregaron tratamientos farmacológicos si correspondía. Los organoides infectados se incubaron a 37 °C con 5 % de CO2 hasta el punto final experimental. En los experimentos durante los cuales se cuantificó el título viral general, se recolectó toda la suspensión de organoide y la muestra se sometió a tres ciclos repetidos de congelación y descongelación para lisar las células antes del ensayo de placas.

Para los experimentos en los que se infectaron colonoides basolaterales diferenciados con EV-A71, los colonoides se cultivaron durante 5 días en medio de crecimiento y se diferenciaron durante 5 días antes de la infección sin retirarlos del andamio de gel BME. El día de la infección, los colonoides se eliminaron de la matriz de BME polimerizada mediante una incubación de 40 min en EDTA 5 mM. Después de lavar una vez con DMEM, los colonoides se resuspendieron en medio de diferenciación frío que contenía inóculo de EV-A71 (MOI 1300 PFU por célula), complementado con BME al 20 % (v/v) para evitar la inversión de polaridad en el cultivo en suspensión. Los colonoides en presencia de EV-A71 se sembraron en placas de cultivo de tejidos de fijación ultrabaja y se incubaron durante 8 h a 37 °C con 5 % de CO2 antes de la fijación.

Para las infecciones por poliovirus, se infectaron organoides diferenciados de íleon y colon apical hacia fuera utilizando la metodología descrita anteriormente para las infecciones por EV-A71. Los organoides del íleon se infectaron a una MOI de 10 UFP por célula y se fijaron a las 22 hpi. Los organoides de colon se infectaron a una MOI de 1 UFP por célula y se fijaron a 42 hpi.

Los organoides se fijaron en paraformaldehído al 2 % en tampón de fosfato de sodio 100 mM (pH 7,4) durante al menos 30 min y se lavaron con PBS. Los organoides se tiñeron incubando con anticuerpos y/o colorantes en tampón de bloqueo/permeabilización (PBS con albúmina de suero bovino al 3 %, saponina al 1 % y azida sódica al 0,02 %) durante la noche con agitación suave. Los organoides teñidos se lavaron tres veces en PBS y se montaron en portaobjetos de vidrio con medio de montaje Vectashield (Vector Laboratories, H-1000), y los cubreobjetos de vidrio se fijaron con grasa de vacío. Se tomaron imágenes de los organoides en un microscopio confocal LSM 700 (Carl Zeiss) con el software Zen 2009 (Carl Zeiss) con un aumento de 40x o 63x con objetivos de inmersión en aceite. Las representaciones 3D de los organoides se generaron utilizando el software de análisis de imágenes 3D Volocity (PerkinElmer versión 5.3).

Los organoides se tiñeron con diclorhidrato de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI; Life Technologies, D1306) y faloidina Alexa Fluor 660 (Invitrogen, n.º de cat. A22285) para visualizar los núcleos y la actina. Las diluciones de anticuerpos primarios se realizaron en las siguientes diluciones: Anticuerpo de cadena Kappa IgG2a anti-dsRNA de ratón (J2) SCICONS (adquirido por Nordic MUbio) cat. No. 10010200, RRID: AB_2651015 (1:500), anticuerpo monoclonal recombinante anti-LIMP2/SCARB2 de conejo (22H6L14), cat. ThermoFisher. No. 703037; RRID: AB_2734813 (1:100), anticuerpo policlonal anti-Muc2 de conejo (H-300) SCBT cat. No. sc-15334 RRID: AB_2146667 (1:200) y anticuerpo IgG anti-VIL1 de conejo Sigma Aldrich cat. No. HPA006885; RRID: AB_1080564 (1:100). Las diluciones de anticuerpos secundarios se realizaron a una dilución de 1:500. Se utilizaron los siguientes anticuerpos secundarios: Anticuerpo secundario de absorción cruzada anti-IgG de ratón de cabra (H + L), Alexa Fluor 488 Invitrogen cat. No. A11001; RRID: AB_2534069; Anticuerpo secundario de adsorción cruzada IgG (H + L) anti-conejo de cabra, Alexa Fluor 488 Invitrogen cat. No. A11008; RRID: AB_143165; Anticuerpo secundario de absorción cruzada IgG anti-ratón de cabra (H + L), Alexa Fluor 555 Invitrogen cat. No. A21422; RRID: AB_2535844; Anticuerpo secundario de adsorción cruzada IgG anti-ratón de cabra (H + L), Alexa Fluor 594 Invitrogen cat. No. A11005; RRID: AB_2534073; Anticuerpo secundario de adsorción cruzada IgG (H + L) anti-conejo de cabra, Alexa Fluor 594 Invitrogen cat. No. A11012; RRID: AB_2534079; Anticuerpo secundario de adsorción cruzada IgG (H + L) anti-ratón de conejo, Alexa Fluor 488 Invitrogen cat. No. A11059; RRID: AB_142495. Cuando se usaron múltiples anticuerpos secundarios en el mismo procedimiento de tinción de organoide, los anticuerpos secundarios usados ​​se generaron en la misma especie huésped (cabra). Para la visualización de la actividad de caspasa 3/7, se añadió reactivo de detección verde CellEvent Caspase 3/7 (Invitrogen, C10723) a organoides vivos a 10 µM después de 24 h de infección, luego los organoides se fijaron a 48 hpi y se tiñeron como se describe anteriormente. Las células individuales que se habían extruido completamente de los organoides se tiñeron y se tomaron imágenes de la misma manera que los organoides intactos como se describe anteriormente; sin embargo, para estos experimentos se utilizó un objetivo seco de 20 aumentos.

Las imágenes de organoides se visualizaron utilizando el software de análisis de imágenes 3D Volocity (PerkinElmer) para obtener una visualización en 3D de cada organoide. Las células dentro de los organoides que se consideraban extruidas, apoptóticas y/o infectadas se contaron manualmente. Una celda de extrusión se definió por una celda unida a un organoide con un núcleo que ha atravesado el borde en cepillo de las microvellosidades del organoide. En los experimentos que requerían el recuento de todas las células, el número total de células en cada organoide se enumeró mediante imágenes DAPI a intervalos de pila z de 6 µm para capturar los núcleos de cada célula organoide en un solo plano z. Volocity se utilizó para cuantificar núcleos individuales a partir de estas imágenes individuales del plano z mediante la función de cuantificación 2D Nuclei.

En experimentos relevantes, la cuantificación de las células no extruidas o no infectadas restantes se calculó restando el número de células contadas manualmente en cada grupo del número total de células en cada organoide.

En experimentos en los que se examinaron células completamente extruidas, se identificaron células individuales a partir de representaciones 3D de imágenes con pilas z a intervalos de 1,8 µm. Se usó el software de análisis de imágenes 3D Volocity (PerkinElmer) para identificar células individuales: los núcleos se identificaron primero usando la función de cuantificación Find Objects, el área del objeto se incrementó para rodear cada núcleo usando la función de cuantificación Dilate Objects dos veces iterativamente, y la intensidad de la señal en cada canal fue capturados con la función Medir objetos. Los objetos con una intensidad Sum en el canal vRNA >2500 se consideraron infectados.

Se ensayaron compuestos farmacológicos y péptidos en cuanto a su capacidad para reducir la extrusión de células infectadas. Para todos los experimentos, los organoides se expusieron a compuestos después de la inoculación viral inicial y los pasos de lavado. Z-VAD-FMK (inhibidor de pan-caspasa, R&D Systems, 21631) y para-nitro-blebbistatina (inhibidor de miosina II, Cayman Chemical, 24171) se solubilizaron en DMSO anhidro y se agregaron a organoides infectados a concentraciones finales de 100 µM y 50 µM, respectivamente. GsMTx4 (inhibidor del canal iónico mecanosensible, Tocris, 4912/100U) se solubilizó en medio de diferenciación y se añadió a los organoides infectados a una concentración final de 20 µM. Para los experimentos en los que se incluyeron compuestos solubilizados en DMSO, las concentraciones finales de DMSO en los pocillos se estandarizaron en todas las condiciones al 0,5 % (v/v).

Los fraccionamientos de las suspensiones de organoides infectados por sedimentación diferencial se realizaron después de 8 h de infección. Todas las muestras se mantuvieron a 4 °C durante el fraccionamiento. Se recogieron muestras de la suspensión entera de organoide (muestras de pozo completo) antes de cualquier paso de sedimentación. A continuación, los organoides se sedimentaron por gravedad (1 g) durante 10 a 15 min. Las muestras se inspeccionaron en un microscopio confocal para confirmar la sedimentación de organoides. Los gránulos que contenían organoides intactos se lavaron tres veces en DMEM y finalmente se resuspendieron en DMEM para futuros análisis (muestras de organoides). El examen de los organoides recolectados mostró una contaminación limitada con células individuales (Datos extendidos Fig. 5 y Tabla complementaria 4). Los sobrenadantes que contenían células extruidas en el medio original (muestras de células + medios) se centrifugaron más a 600 g durante 3 min para generar muestras de células y medios. Los sedimentos de células se lavaron de manera similar tres veces en DMEM y se resuspendieron en DMEM para análisis futuros (muestras de células); no se observaron organoides en estas preparaciones. También se recogieron los sobrenadantes del centrifugado de 600 g (muestras de medios). En experimentos con un agregado de virus exógeno para garantizar que los pasos de lavado fueran suficientes para eliminar la contaminación viral libre de las fracciones celulares, se agregaron 106 UFP de reserva de virus EV-A71 a las muestras de Cells + Media y los pasos de lavado se realizaron como se describe anteriormente. Todas las fracciones se sometieron a tres ciclos de congelación y descongelación para liberar el virus intracelular en fracciones que contenían células u organoides antes de la determinación de los títulos de virus mediante ensayo de placas.

Las células extruidas de los organoides infectados se recogieron como en los experimentos de fraccionamiento anteriores. Después de la granulación por gravedad para eliminar los organoides, las células extruidas se hicieron fluir a través de un filtro de células de malla de nailon de 70 µm. En los casos en que se observaron pequeños organoides fluyendo a través de un filtro de 70 µm, estos se eliminaron mediante una centrifugación adicional de 10 g durante 3 min. Durante el tercer lavado (final) de las células extruidas, se usó medio de diferenciación frío para lavar las células. El sobrenadante de este lavado se retuvo y se usó como inóculo en infecciones paralelas para monitorear los niveles de virus que pueden ser el resultado de una eliminación incompleta del virus libre de células. El sedimento que contenía células extruidas se resuspendió en medio de diferenciación frío y se usó inmediatamente como inóculo en nuevas células u organoides. Las células RD infectadas secundariamente se sembraron en placas de 24 pocillos 1 o 2 días antes de la infección, se lavaron una vez con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco con Ca+2 y Mg+2 (DPBS++) inmediatamente antes de la infección, se inocularon durante 1 h a 37 °C con Se lavan 150 µl de sobrenadante o células extruidas y se lavan de nuevo con DPBS++ antes de añadir 1 ml por pocillo de medio de células RD. El medio celular se recogió y se congeló a -20 °C inmediatamente después de la infección (1 h) o después de 16 h de infección. Se realizaron infecciones secundarias de organoides utilizando los métodos descritos anteriormente para infecciones de organoides con EV-A71; sin embargo, dado que el uso inmediato de células extruidas como inóculo hizo imposible cuantificar el título viral de los inóculos antes de su uso en infecciones secundarias, las células infectadas secundariamente no se contaron para determinar la MOI antes de la infección.

El análisis de datos estadísticos se realizó en GraphPad Prism 9. A menos que se indique lo contrario, todos los experimentos se realizaron tres veces independientes utilizando múltiples líneas distintas de donantes de organoides para tener en cuenta las diferencias específicas de los donantes. En los experimentos en los que se muestran los datos de un experimento representativo, los hallazgos experimentales se reprodujeron utilizando organoides de una línea donante adicional. Todas las imágenes de microscopía que se muestran son representativas de experimentos en los que se examinaron un mínimo de diez organoides con resultados similares. Para los datos de microscopía cuantitativa en el texto principal (Figs. 2d, e, 3f y 4f), se realizaron tres experimentos independientes que examinaron al menos diez organoides cada uno; los valores medios de experimentos independientes se usaron para pruebas estadísticas. En los gráficos de microscopía, los círculos representan medidas de organoides individuales (réplicas técnicas), mientras que los triángulos representan medidas obtenidas al acumular datos de todos los organoides del mismo experimento (réplicas biológicas). El color de los símbolos clasifica los experimentos independientes. Este formato de gráfico 'SuperPlot' utilizado aquí ha sido descrito en detalle por Lord et al.59. En todos los gráficos, los datos se presentan como media ± desviación estándar (sd). La información sobre pruebas estadísticas específicas en cada análisis se puede encontrar en las leyendas de las figuras. Para las pruebas estadísticas gaussianas utilizadas, se supuso que la distribución de datos era normal, pero esto no se probó formalmente. Los valores P exactos de las pruebas estadísticas se pueden encontrar en los archivos de datos de origen. No se utilizaron métodos estadísticos para predeterminar los tamaños de muestra, pero nuestros tamaños de muestra son similares a los informados en publicaciones anteriores9,10,13.

Dentro de cada experimento independiente, las muestras (organoides) se asignaron al azar a los grupos experimentales. Para reducir las oportunidades de error del operador, la organización de las condiciones experimentales presentadas (por ejemplo, el diseño de la placa) no fue aleatoria. La recopilación de datos de títulos virales (recuento de placas) se realizó con aleatorización y con cegamiento de las muestras por parte del investigador. Debido a que la recopilación de datos microscópicos requiere mucho tiempo, no se aplicaron la aleatorización ni el cegamiento.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

En este estudio no se generaron conjuntos de datos con deposición obligatoria. Todos los datos gráficos sin procesar y las pruebas estadísticas asociadas están disponibles como archivos de datos de origen. Los datos de origen se proporcionan con este documento. Otros datos que respaldan los hallazgos de este estudio, incluidos los archivos de imágenes de microscopía sin procesar, están disponibles del autor correspondiente a pedido.

El código no es aplicable.

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Descargar referencias

Agradecemos a J. Co, M. Margalef-Català y K.-F. Weng por compartir experiencia y reactivos, C. Kuo (Universidad de Stanford) por la generosa provisión de líneas de células organoides, J. Theriot, M. Ott y B. Burkholder por la discusión científica, y P. Sarnow y J. Carette por la lectura crítica de el manuscrito. Las ilustraciones fueron creadas en Biorender.com. Este trabajo fue apoyado por Chan-Zuckerberg BioHub (KK), BioX de la Universidad de Stanford (ARC), la subvención de la Fundación Novo Nordisk NNF19OC0056411 (MRA) y las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud R01AI13491204 (KK), 5U19AI116484-06 (MRA), T32GM007276 ( JM) y T32AI1007328 (JM). Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación y el análisis de datos, la decisión de publicar o la preparación del manuscrito.

Estos autores supervisaron conjuntamente este trabajo: Manuel R. Amieva, Karla Kirkegaard.

Departamento de Microbiología e Inmunología, Universidad de Stanford, Stanford, CA, EE. UU.

Jasmine Moshiri, Manuel R. Amieva y Karla Kirkegaard

Departamento de Genética, Universidad de Stanford, Stanford, CA, EE. UU.

Ailsa R. Craven, Sarah B. Mixon y Karla Kirkegaard

Departamento de Pediatría, Universidad de Stanford, Stanford, CA, EE. UU.

Manuel R. Amieva

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JM concibió, diseñó y ejecutó experimentos, analizó datos y redactó el manuscrito original. KK participó en la concepción de la investigación propuesta y el diseño de experimentos. ARC contribuyó a los experimentos en las Figs. 1b y 5b–i y experimentos ejecutados en Datos extendidos Figs. 2 y 7. SM realizó la microscopía para la Fig. 4 y los datos extendidos de la Fig. 3. KK y MRA supervisaron conjuntamente la investigación y participaron en la interpretación de los resultados. KK, MRA y JM adquirieron financiación. JM, KK y MRA editado y revisado el manuscrito.

Correspondencia a Karla Kirkegaard.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Microbiology agradece a Nihal Altan-Bonnet, Stanley Perlman y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Se observaron células infectadas con poliovirus Tipo 1 (Mahoney) saliendo de organoides por inmunofluorescencia. ( ab ) Organoides de colon infectados con una MOI = 1 PFU / célula durante 42 h. La MOI se determinó mediante el título viral en células HeLa. Las barras de escala equivalen a 10 μm.

Los colonoides diferenciados con polaridad organoide basolateral hacia fuera se infectaron con EV-A71 y se visualizaron mediante inmunofluorescencia 8 horas después de la infección. (a) Se observó una fuerte tinción con actina F del borde en cepillo de las microvellosidades apicales en la luz interior de los colonoides infectados. Las células infectadas por virus se pueden observar tanto dentro de la capa epitelial como dentro de la luz apical. ( b, c ) Las células infectadas con EV-A71 se extruyeron apicalmente en el lumen interior de los colonoides basolaterales hacia afuera. Las barras de escala equivalen a 10 μm.

(a) Los organoides infectados se fijaron en puntos de tiempo durante el primer ciclo de infección y el número de células infectadas y no infectadas se enumeró mediante microscopía de fluorescencia. Cada punto representa la proporción de células infectadas dentro de un organoide individual; los triángulos representan valores promediados en todos los organoides para cada punto de tiempo. Un experimento con N = 10 organoides cuantificados por punto de tiempo. Un pico en la proporción de células infectadas dentro de los organoides surgió a las 7 hpi y se redujo después de las 9 hpi. Los números de células sin procesar representados en este gráfico se muestran en la Tabla complementaria 2. ( b – d ) Células infectadas representativas de cada punto de tiempo. Las células infectadas extruidas contienen una señal de ARNv igualmente abundante, independientemente del punto de tiempo visualizado. Las barras de escala equivalen a 10 μm.

Datos fuente

Las células que se habían extruido completamente de los colonoides infectados en presencia del sustrato fluorógeno de caspasa 3/7 CellEvent se recogieron a 48 hpi, se fijaron y se examinaron mediante microscopía de fluorescencia con un aumento de 20x. ( a ) Las representaciones 3D de las células con imágenes se visualizaron utilizando el software de análisis de imágenes Volocity. Las células infectadas están rodeadas de cuadros amarillos. (b) Las celdas individuales se identificaron a partir de 20 campos de visión únicos como en A usando herramientas de medición computacional en Volocity. Los datos se recogieron de N = 743 células individuales. Las células con intensidades de píxeles superiores a 1,5 por micra cúbica en el canal de ARNv se identificaron como infectadas; N = 39 células infectadas, 5,2% del total. ( c ) Se comparó la actividad de caspasa 3/7 de las células definidas en B. La actividad de la caspasa en las células infectadas fue comparable a la de las células no infectadas; prueba t de dos colas no apareada; datos presentados como media ± SD; N = 39 células infectadas; N = 704 células no infectadas.

Datos fuente

Después del fraccionamiento de los cultivos de organoides, todas las fracciones se examinaron visualmente en un microscopio de cultivo de tejidos para evaluar la recolección de las poblaciones objetivo. (a) El examen visual de la fracción de organoides con un aumento de 40x confirma que los organoides se recolectan con gránulos de gravedad (1 xg). ( b ) Región resaltada en A. Las células individuales también estaban presentes en baja abundancia en la fracción de organoides (las flechas indican ejemplos), posiblemente como resultado de la extrusión celular en curso de los organoides durante el fraccionamiento (puntas de flecha).

Proporcionamos dos hipótesis para posibles medios de activación de canales iónicos mecanosensibles en células infectadas que pueden impulsar la extrusión de células infectadas. Los canales iónicos mecanosensibles como Piezo1 pueden activarse mediante (a) fuerzas de compresión externas que inducen la deformación de la membrana, así como (b) fuerzas mecánicas intrínsecas de la célula transmitidas a través de filamentos del citoesqueleto atados. ( c, d ) Presentamos modelos conceptuales de cómo la infección viral puede inducir la activación del canal a través de fuerzas intrínsecas o externas a la célula. (c) En las células no infectadas, los filamentos del citoesqueleto brindan soporte estructural debajo de la membrana plasmática, lo que reduce la deformación de la membrana por las fuerzas extrínsecas de la célula. En las células infectadas en las que la actina se reorganiza, este soporte estructural puede faltar, lo que da como resultado membranas "más blandas" que se deforman más fácilmente por las fuerzas de compresión externas. (d) En el modelo de fuerza a través del filamento, las fuerzas mecánicas intrínsecas de la célula se transmiten a los canales piezoeléctricos a través de la unión a los filamentos del citoesqueleto. En las células infectadas, los reordenamientos del citoesqueleto pueden transmitir fuerzas directamente a los canales piezoeléctricos atados, induciendo la activación. Adaptado de 'Canales PIEZO: ¿Cómo permiten la mecanosensación?', de BioRender.com (2022). Obtenido de https://app.biorender.com/biorender-templates.

Se infectaron organoides epiteliales diferenciados apicalmente derivados de tejido (a) gástrico y (b) duodenal humano con Enterovirus A-71. El título viral se controló a lo largo del tiempo mediante un ensayo de placas. Los datos de un único donante y experimento por panel se muestran por triplicado técnico. Los datos representados son la media ± SD.

Datos fuente

Tablas complementarias 1–4.

Fuente de datos estadísticos.

Fuente de datos estadísticos.

Fuente de datos estadísticos.

Fuente de datos estadísticos.

Fuente de datos estadísticos.

Fuente de datos estadísticos.

Fuente de datos estadísticos.

Fuente de datos estadísticos.

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Reimpresiones y permisos

Moshiri, J., Craven, AR, Mixon, SB et al. Extrusión mecanosensible de células infectadas con Enterovirus A71 a partir de organoides colónicos. Nat Microbiol 8, 629–639 (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01339-5

Descargar cita

Recibido: 31 julio 2022

Aceptado: 10 febrero 2023

Publicado: 13 de marzo de 2023

Fecha de emisión: abril de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-023-01339-5

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