La metatranscriptómica revela la temperatura

Scientific Reports volumen 6, Número de artículo: 21871 (2016) Citar este artículo

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Los quesos tradicionales albergan consorcios microbianos complejos que juegan un papel importante en la configuración de las propiedades sensoriales típicas. Sin embargo, el metabolismo microbiano se considera difícil de controlar. Se analizó la sucesión de la comunidad microbiana y la expresión génica relacionada durante la maduración de un queso italiano tradicional, identificando parámetros que podrían modificarse para acelerar la maduración. Posteriormente, modulamos las condiciones de maduración y observamos cambios consistentes en la estructura y función de la comunidad microbiana. Proporcionamos evidencia concreta de la contribución esencial de las bacterias del ácido láctico no iniciadoras en las actividades relacionadas con la maduración. Un aumento en la temperatura de maduración promovió la expresión de genes relacionados con la proteólisis, la lipólisis y el catabolismo de aminoácidos/lípidos y aumentó significativamente la tasa de maduración del queso. Además, los metabolismos microbianos promovidos por la temperatura fueron consistentes con los perfiles metabolómicos de proteínas y compuestos orgánicos volátiles en el queso. Los resultados indican claramente cómo se pueden modular las respuestas del microbioma impulsadas por el procesamiento para optimizar la eficiencia de producción y la calidad del producto.

El queso es una matriz biológica y bioquímicamente dinámica, donde la estructura y la actividad de la microbiota están influenciadas por las prácticas de fabricación y las condiciones ambientales. Los quesos tradicionales emplean cultivos iniciadores seleccionados de forma natural con una amplia diversidad genética, o no utilizan ningún iniciador1,2. Por lo tanto, los quesos tradicionales albergan una microbiota rica y compleja, derivada del uso de cultivos de suero natural indefinidos (NWC, por sus siglas en inglés) utilizados según un procedimiento de back-slopping, pero también de la leche cruda y del medio lácteo3, cuyo papel durante la fabricación y la maduración es reconocido pero a menudo poco explorado. La fabricación de queso se caracteriza por una sucesión de diferentes especies de bacterias del ácido láctico (BAL). La acidificación de la cuajada está impulsada principalmente por LAB termófilas, principalmente Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii y Lb. helveticus2,4,5, mientras que las LAB no iniciadoras mesófilas (NSLAB) toman el control durante la maduración y pueden participar en el desarrollo del sabor y la textura del queso6,7,8,9,10,11. La microbiota juega un papel importante en la configuración de las propiedades sensoriales típicas del queso12,13. Sin embargo, estos complejos consorcios microbianos son a menudo difíciles de controlar y su dinámica y evolución durante la elaboración y maduración del queso no pueden predecirse fácilmente. Comprender el comportamiento microbiano durante la maduración del queso y cómo los parámetros tecnológicos aplicados pueden influir en la dinámica de elaboración del queso y la calidad del producto final son pasos fundamentales para garantizar la seguridad y la calidad3,14. Además, acelerar la cinética de maduración a través de la modulación de las actividades microbianas puede ser extremadamente importante para las lecherías tradicionales, de pequeña escala y más industrializadas. Con este control pueden reducir los costos operativos, aumentar la rotación de las cámaras de maduración y optimizar la eficiencia del proceso teniendo como prioridad la calidad del queso. El estudio de la ecología microbiana dinámica y el metabolismo durante la elaboración del queso utilizando enfoques multiómicos puede ayudar a mejorar la eficiencia14,15. La metatranscriptómica se ha utilizado recientemente para estudiar cultivos de cepas inoculadas en quesos modelo16,17, pero la dinámica de transcripción de comunidades complejas sigue sin explorarse. Por otro lado, las comunidades microbianas de alimentos fermentados no son tan complejas como las de otros entornos naturales y pueden ser un sistema reproducible y manejable para estudiar la dinámica del ensamblaje microbiano y cómo pueden ser manipulados por factores abióticos18.

La caracterización longitudinal de la estructura de la comunidad microbiana y la expresión génica se realizó durante la maduración del queso tradicional italiano Caciocavallo Silano. Este es un típico queso de pasta filata de maduración media producido con la adición de NWC como iniciador natural. La investigación inicial, reportada aquí, identificó parámetros que podrían modificarse para acelerar la maduración. Por lo tanto, establecimos un segundo experimento, en el que se modularon las condiciones de maduración y se observaron cambios consistentes en la estructura y función de la comunidad microbiana. Revelamos cómo el aumento de la temperatura de maduración afecta el metabolismo microbiano, lo que aumenta significativamente la tasa de maduración del queso.

La maduración del queso se exploró en dos experimentos separados. En primer lugar, se realizó un análisis de la estructura de la comunidad microbiana (amplicón de ARNr 16S) y una exploración superficial de la expresión génica (metatranscriptómica) en leche de vaca cruda y termizada, cultivo de suero natural, cuajada después de 5 horas de fermentación y antes del estirado, quesos después de la salmuera y durante el maduración a los 0, 10, 20, 30 y 60 días. De esta forma, identificamos qué actividades/vías bacterianas se expresaban más durante la producción y maduración de un queso de pasta filata, lo que proporcionó los parámetros necesarios para entender cómo acelerar la maduración.

Luego, establecimos un segundo experimento, caracterizando el microbioma a lo largo de 30 días, para quesos madurados en tres condiciones diferentes: (A) condiciones estándar en la lechería (16 °C y 75% HR), (B) aumentando la temperatura a 20 °C y (C) disminuyendo la HR al 65%.

Obtuvimos un total de 3,3 Gbp en el primer experimento y 19,8 Gbp en el segundo experimento. En el primer experimento, se obtuvo un promedio de 876 295 lecturas/muestra (±409 657) y un promedio del 22 % de las lecturas asignadas de forma única a los genomas de referencia (entre 12 y 27,8 %).

En el segundo experimento, obtuvimos un promedio de 1 180 7044 lecturas/muestra (± 5,9 millones) y un promedio de 35,5 % de lecturas asignadas de forma única a los genomas de referencia (entre 23,9 y 58,6 %). La abundancia normalizada (lecturas por millón) de los genes identificados para cada especie y la abundancia relativa de OTU (%) se informan en las tablas complementarias S1 y S2.

La maduración del queso fue impulsada por pocos lactobacilos no iniciadores, por ejemplo, Lb. casei y Lb. buchneri, grupos cuya abundancia fue mayor en el corazón del queso en comparación con la corteza. Este resultado fue consistente en ambos experimentos llevados a cabo en este estudio. Los firmicutes fueron el filo que diferenció más significativamente la microbiota del núcleo y la corteza (Fig. 1 complementaria). Las cargas microbianas en el agar MRS incubado a 30 °C aumentaron durante la maduración, con valores mayores en el núcleo del queso, mientras que los lactobacilos termófilos y los estreptococos disminuyeron progresivamente (Tabla complementaria 3). Cuando comparamos tres condiciones de maduración diferentes (segundo experimento), las NSLAB a los 10 días de maduración fueron significativamente más abundantes cuando se redujo la humedad relativa (C–17,2 %) y cuando se incrementó la temperatura de maduración (B–15,3 %) en comparación con las condiciones de control (A-8,3%) (P < 0,05). Sin embargo, en la condición de humedad relativa reducida (C), la abundancia de NSLAB disminuyó rápidamente después de 10 días de maduración. Curiosamente, Lb. fermentum, que no se detectó en la condición de control, apareció en la condición de mayor temperatura (B) después de 10 días y continuó aumentando en abundancia a lo largo de la maduración.

Los resultados del primer experimento mostraron que la cuajada y el queso después del moldeado y la salmuera se caracterizaron por la prevalencia de genes implicados en el metabolismo de los carbohidratos. Durante la maduración, el metabolismo de los carbohidratos (vía de las pentosas-fosfato, glucólisis) y la división celular (procesamiento de la información genética y procesos celulares centrales) se enriquecieron en las cortezas de queso, mientras que los núcleos de queso se caracterizaron por un metabolismo significativamente elevado de aminoácidos y lípidos (Fig. 1) . Además, las muestras maduradas a mayor temperatura (B) durante el segundo experimento mostraron un aumento en la expresión de vías relacionadas con el metabolismo de aminoácidos y lípidos (Fig. 2a) y genes asociados (Fig. 2b) en comparación con el control (A) en los mismos tiempos de maduración. Los genes relacionados con la vía Leloir de degradación de galactosa se sobreexpresaron en comparación con la vía tagatosa-6-fosfato. Las enzimas responsables de la descomposición de la lactosa (lacZ, EC 3.2.1.23 y lacG, EC 3.2.1.85), las rutas de Leloir y tagatosa mostraron una expresión máxima en las primeras etapas de fabricación y disminuyeron durante la maduración (Fig. 2 complementaria). Las enzimas que conducen a la producción de acetoína y diacetilo se regularon al alza en la corteza y tuvieron una expresión significativamente mayor a la temperatura más alta (B en comparación con A; Fig. 3 complementaria). Además, varias peptidasas, permeasas de aminoácidos y péptidos, lipasas y genes involucrados en el catabolismo de aminoácidos y la β-oxidación de ácidos grasos se sobreexpresaron en el núcleo de los quesos madurados a temperaturas más altas (Fig. 2b y Tabla complementaria 4) . Finalmente, una temperatura más alta impulsó la expresión de genes involucrados en la biosíntesis de ácidos grasos a partir de piruvato (Fig. 3). El análisis DESeq identificó 651 genes expresados diferencialmente entre los núcleos de queso madurados en las condiciones A y B (valor P < 0,05) independientemente del tiempo de maduración (Tabla complementaria 4). Entre ellos, las proteasas, peptidasas, transportadores de dipéptidos, permeasas de aminoácidos, genes de catabolismo de aminoácidos, β-oxidación de ácidos grasos y biosíntesis se sobreexpresaron en el núcleo de las muestras B en comparación con A (Tabla complementaria 4).

El metatranscriptoma impulsa la separación del núcleo y la corteza del queso.

PCA basado en la abundancia de las anotaciones KEGG en el nivel 2 de jerarquía de las muestras de núcleo y corteza de queso del primer experimento realizado en este estudio. El primer componente (horizontal) explica el 65,7% de la varianza y el segundo componente (vertical) explica el 12,2%. CO, muestras de núcleo de queso; CR, muestras de corteza de queso.

La temperatura más alta promueve la expresión de genes relacionados con la maduración.

Agrupamiento de enlaces promedio de muestras del segundo experimento basado en la distancia euclidiana de la proporción de las vías KEGG (superior) o genes (inferior) pertenecientes a los metabolismos de carbohidratos (violeta), aminoácidos (naranja) y lípidos (cian). La barra de la columna está codificada por colores de la siguiente manera: rojo, queso en t0; azul, queso madurado en condiciones estándar, verde, queso madurado a temperatura más alta. La escala de colores representa la abundancia escalada de cada variable, indicada como puntuación Z, donde el rojo indica abundancia alta y el azul indica abundancia baja. En los identificadores de muestra, la primera parte indica el tiempo de maduración (desde t0, queso después de la salmuera y el secado, hasta los 30 días de maduración); CO, núcleo o CR, corteza; A, maduración en condiciones estándar; B, temperatura más alta.

Vías que conducen a la producción de ácidos grasos a partir de aminoácidos.

Biosíntesis de ácidos grasos a partir del piruvato (A) y del catabolismo de los aminoácidos de cadena ramificada (B). Solo se informan los genes KEGG identificados en las muestras analizadas y su abundancia se muestra en el diagrama de calor (C). El agrupamiento de ligamiento promedio se basa en la distancia de Spearman de la proporción de los genes KEGG. Solo se muestran muestras del segundo experimento. La barra de la columna está codificada por colores de la siguiente manera: rojo, queso en t0; queso azul madurado en condiciones estándar; verde, queso madurado a mayor temperatura. La escala de colores representa la abundancia escalada de cada variable, indicada como puntuación Z, donde el rojo indica abundancia alta y el azul indica abundancia baja. En los identificadores de muestra, la primera parte indica el tiempo de maduración (desde t0, queso después de la salmuera y el secado, hasta los 30 días de maduración); CO, núcleo o CR, corteza; A, maduración en condiciones estándar; B, temperatura más alta. *La malonil-CoA se puede sustituir por propanoil-CoA, lo que da lugar a ácidos grasos de cadena impar. **Para cada ciclo, se agregan 2 átomos de carbono.

La expresión del metabolismo de aminoácidos se asoció predominantemente con Firmicutes, lo que sugiere un claro efecto de la temperatura en el metabolismo de este filo (Fig. 4). Específicamente, la expresión del metabolismo de aminoácidos de Lb. casei pareció aumentar significativamente bajo la temperatura elevada. Sin embargo, otros taxones de NSLAB (como Lb. buchneri, Lb. plantarum, Lb. gasseri, Lb. fermentum, Lb. rhamnosus, Leuconostoc kimchii, Leuc. mesenteroides, Leuc. citreum, Pediococcus pentosaceus) también mostraron una mayor actividad metabólica de aminoácidos en la temperatura más alta. Una red que muestra correlaciones significativas (FDR < 0.05) de Spearman entre genes KEGG, OTU y metaboloma sugiere claramente que la abundancia de NSLAB se correlacionó positivamente con genes involucrados en el metabolismo de aminoácidos y ácidos grasos, así como la abundancia de compuestos volátiles, lipólisis y índices de proteólisis (fig. 5). Además, las actividades asociadas a la maduración estaban inversamente relacionadas con la abundancia de LAB termófilas del iniciador natural (Fig. 5).

La temperatura más alta aumenta el metabolismo de los aminoácidos NSLAB.

Asignación taxonómica de los genes pertenecientes al metabolismo de aminoácidos KEGG en las muestras de corazón de queso del segundo experimento, a los 30 días de maduración. Solo se reportan especies pertenecientes a Firmicutes. A, maduración en condiciones estándar; B, temperatura más alta.

La abundancia de NSLAB, la expresión génica relacionada con la maduración y el metaboloma están fuertemente relacionados.

Red que muestra correlaciones de Spearman significativas (FDR < 0,1) entre genes KEGG pertenecientes al metabolismo de aminoácidos y lípidos, VOC, índices de lipólisis y proteólisis y OTU pertenecientes a Firmicutes identificados mediante secuenciación de ARNr 16S. El tamaño del nodo se hizo proporcional al número de correlaciones significativas. El color del borde indica correlaciones negativas (azul) o positivas (gris). El color de los nodos se asignó de la siguiente manera: verde, genes KEGG relacionados con el metabolismo de los aminoácidos; rojo, genes KEGG relacionados con el metabolismo de los lípidos; amarillo, COV; magenta, índices químicos; cian, Firmicutes OTU.

La mayor temperatura de maduración también promovió el desarrollo de compuestos de sabor, tanto en el corazón como en la corteza del queso (Cuadro 1). Los perfiles metabolómicos fueron muy consistentes con los perfiles de expresión del análisis metatranscriptómico. Los ácidos grasos volátiles de cadena corta (ácidos butanoico, pentanoico, hexanoico, heptanoico, octanoico y decanoico) fueron los volátiles más abundantes, junto con las 2-metilcetonas y los compuestos alcohólicos, como el hexanol, el 2-heptanol, el 1-butanol y el 3-butanol. butanol de metilo. Las metilcetonas, los alcoholes secundarios y los ácidos grasos libres aumentaron en abundancia durante la maduración y aumentaron a mayor temperatura, lo que también se observó para el 3-metilbutanol (P < 0,05). Los ácidos grasos libres pueden surgir de la lipólisis directa de los triacilgliceroles, o pueden sintetizarse ex novo a partir del piruvato evolucionado a partir del catabolismo de aminoácidos (Fig. 3). Los índices de lipólisis y proteólisis fueron mayores en el corazón y aumentaron en el queso madurado a mayor temperatura (Cuadro 1). En consecuencia, el análisis LC/MS de la fracción de nitrógeno insoluble de pH 4,6 mostró una degradación extensa de la caseína αs1 y β en el queso madurado a temperatura más alta, mientras que la fracción soluble de pH 4,6 mostró una mayor cantidad de péptidos solubles derivados de la dos proteínas (Fig. 4 complementaria).

El proceso de maduración del queso es muy complejo e implica cambios microbiológicos y bioquímicos que conducen al desarrollo de un sabor y una textura específicos. El microbioma del queso está formado por los factores abióticos que se encuentran durante la maduración (pH, aw, concentración de NaCl, disponibilidad de O2). Por lo tanto, pueden ocurrir diferentes dinámicas en el corazón y la corteza del queso, debido a las diferentes condiciones ambientales3,19. Recientemente se destacó la importancia de las actividades metabólicas asociadas a hongos y bacterias en los quesos madurados en la superficie16,17,20, mientras que anteriormente se observó un aumento de NSLAB en los quesos madurados7,10. Las NSLAB se conocen como proteolíticas21,22,23 y se demostró que el complemento de cultivos seleccionados aumenta los niveles de proteolisis8,24,25, lo que sugiere que pueden desempeñar un papel clave durante la maduración del queso. Brindamos evidencia concreta de su contribución esencial, mostrando que una estructura y funcionalidad diferente del microbioma evoluciona en el núcleo y la corteza del queso y que la maduración procede con un gradiente que comienza desde el núcleo hacia la corteza, impulsado por la sucesión de NSLAB. En la superficie del queso, donde las concentraciones de O2 más bajas y más altas hacen que el ambiente sea adverso, el desarrollo de NSLAB se retrasa y el metabolismo celular se dirige hacia la multiplicación y la producción de energía a partir de carbohidratos. Consistentemente, la descomposición de la lactosa y el metabolismo de la galactosa se retrasaron en la corteza del queso y sus niveles se mantuvieron constantemente más altos en la corteza en comparación con el núcleo. Además, las actividades microbianas están fuertemente influenciadas por las condiciones aplicadas durante la maduración. No podemos vincular exclusivamente los niveles más altos de proteólisis con la actividad bacteriana y las enzimas endógenas pueden seguir activas en el queso sin un paso de cocción de la cuajada. Sin embargo, una clara contribución bacteriana a las actividades de maduración está respaldada por la consistencia entre los datos del metatranscriptoma y el metaboloma y por el grado significativo de correlación entre la aparición de NSLAB, los perfiles de expresión y los patrones metabólicos (Fig. 5). En particular, la expresión génica bacteriana de las actividades asociadas a la maduración está significativamente relacionada con los perfiles de metabolitos y los índices de proteólisis y lipólisis.

El aumento de la proteólisis, la lipólisis y el catabolismo de aminoácidos/ácidos grasos impulsado por la temperatura más alta definitivamente promovió la producción de compuestos volátiles. Los ácidos grasos libres observados pueden surgir de la lipólisis directa de los triacilgliceroles, así como de la biosíntesis ex novo del piruvato producido por el catabolismo de aminoácidos26. Además, el 3-metilbutanol se produce por degradación de la leucina y las metilcetonas y los alcoholes secundarios provienen del catabolismo de los ácidos grasos27,28.

Recientemente, se destacó la importancia de explorar los mecanismos de ensamblaje microbiano en alimentos fermentados (MCoFF)18. Los alimentos fermentados brindan oportunidades tentadoras para estudiar los patrones metabólicos microbianos y la dinámica ecológica, identificando los principales impulsores y probando hipótesis que pueden extrapolarse fácilmente a entornos más complejos18. Damos un ejemplo claro de cómo podrían usarse para comprender el efecto de los factores abióticos en el ensamblaje y el metabolismo de la comunidad microbiana. Esto respalda el potencial para modelar la dinámica de la comunidad microbiana en entornos más complejos18.

El aumento de la temperatura de maduración promueve la expresión de genes relacionados con la proteólisis y el transporte y catabolismo de aminoácidos/lípidos, lo que conduce a una mayor concentración de aminoácidos libres y ácidos grasos y aumenta la producción de COV que se encuentra típicamente en el volatilome del queso Caciocavallo7, lo que posiblemente acelere la maduración y potenciando el impacto potencial del sabor del queso. De hecho, los quesos madurados a temperaturas más altas durante solo 20 días tenían perfiles transcriptómicos muy similares a los de los quesos madurados durante más tiempo a temperatura estándar, lo que indica que la actividad relacionada con la maduración se ve potenciada por el cambio en las condiciones de maduración. Finalmente, la asignación taxonómica de genes relacionados con las vías del metabolismo de los aminoácidos KEGG confirmó un cambio en el metabolismo de los aminoácidos debido a la temperatura más alta y enfatizó el papel de NSLAB como actores fundamentales en la maduración del queso.

Los resultados indican claramente cómo los cambios en las condiciones de maduración son importantes para manipular el microbioma del queso y sus actividades y que la respuesta del microbioma se puede utilizar rápidamente para mejorar las condiciones de procesamiento y la calidad del producto.

La elaboración y maduración del queso se llevó a cabo en una quesería ubicada en el Sur de Italia y productora de queso Caciocavallo Silano con Denominación de Origen Protegida (DOP, CE Reg. 1263/96). En un primer experimento, leche de vaca cruda y termizada, NWC, cuajada después de 5 h de fermentación y antes del estirado (cuando el pH alcanzó ca. 5,25), quesos después del moldeado, después de la salmuera y durante la maduración (a los 10, 20, 30 y 60 días) se recogieron y analizaron a través de secuenciación de ARNr 16S y RNA-seq (Tabla complementaria 5). En un segundo experimento, con el fin de evaluar el efecto de los parámetros de maduración en el microbioma, decidimos madurar los quesos de la misma elaboración en tres condiciones diferentes: una maduración de control (A) usando las condiciones estándar en la lechería (16 ° C y 75% HR, condición A), aumentando la temperatura a 20 °C (B) o disminuyendo la HR a 65% (C). En este segundo experimento, los quesos madurados se recogieron hasta los 30 días. Los ID de muestra informados en la Tabla complementaria 5 y en todo el texto y las cifras se asignaron de la siguiente manera: la primera parte del ID indica el tiempo de maduración (desde t0, queso después de salmuera y secado, hasta 60 días de maduración); CO, núcleo o CR, corteza; A, maduración en condiciones estándar, B, maduración a mayor temperatura, C, maduración a menor HR.

La actividad del agua (aw) se midió usando un instrumento HygroPalm23-AW (Rotronic AG, Basserdorf).

Las muestras del corazón (la parte interior, recogida en el medio del queso) y la corteza (la parte exterior, después de pelar la capa externa) se cortaron (en rodajas de ~0,5 cm de espesor) en condiciones estériles y se analizaron por separado. Se recolectaron diferentes alícuotas de cada muestra en bolsas plásticas estériles para los diferentes análisis y se transportaron al laboratorio en condiciones de refrigeración (4 °C). Se añadió RNAlater (Ambion, Foster City, California) en una proporción de 1:6 a la alícuota que se usaría para la extracción de ARN antes del transporte. Las muestras se almacenaron a -80 °C antes de los análisis, a excepción de los recuentos microbianos, que se realizaron dentro de las 2 h posteriores al muestreo, de la siguiente manera.

Se homogeneizaron veinticinco gramos (sólidos) o 25 ml (líquidos) de muestra en cada momento del muestreo y en cada condición de maduración en 225 ml de solución de Ringer de un cuarto de potencia (Oxoid, Milán, Italia) durante 2 min en un Stomacher ( LAB Blender 400) usando bolsas estomacales Sto-Circul-Bag (ambas de PBI, Milán, Italia) a temperatura ambiente. Se prepararon diluciones decimales en solución de Ringer de un cuarto de concentración y se inocularon alícuotas de 1 ml de las diluciones apropiadas por triplicado en agar M17 o MRS (Oxoid, Milán, Italia) y se incubaron aeróbica y anaeróbicamente, respectivamente, a 30 o 42 °C durante 48 h para obtener los recuentos viables de estreptococos mesófilos y termófilos o lactobacilos. Los resultados se calcularon como la media del logaritmo de unidades formadoras de colonias (UFC)/g para tres determinaciones independientes.

Las muestras almacenadas en ARN se homogeneizaron posteriormente y 10 ml de la mezcla se centrifugaron durante 10 min a 4 °C (12 000 × g). Se sometieron a extracción de ARN dos réplicas biológicas (dos quesos diferentes en cada punto de muestreo y para cada condición) y se combinó el ARN total antes del procesamiento adicional. El sedimento se lavó dos veces en PBS (solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4) y la extracción de ARN se realizó por duplicado utilizando el kit de aislamiento de ARN PowerMicrobiome (MoBio, Carlsbad, California). El ADN se eliminó mediante un tratamiento con TURBO-DNase (Ambion, Foster City, California) durante 3 h a 37 °C. Se comprobó la ausencia de ADN por PCR y se repitió el tratamiento si era necesario. La calidad del ARN se comprobó por electroforesis en gel de agarosa y por el 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, California). Para la cuantificación se utilizaron el Qubit y el kit de ensayo de ARN Qubit (Life Technologies, Carlsbad, California).

El ADN complementario (ADNc) se sintetizó utilizando el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems, Carlsbad, California), a partir de 200 ng de ARN total. La diversidad microbiana se estudió mediante pirosecuenciación de la región V1-V3 amplificada del ARNr 16S como se informó en otro lugar29. Las condiciones de PCR, la preparación de la biblioteca y la secuenciación se llevaron a cabo tal como se ha descrito recientemente30.

Se estudió el metatranscriptoma para todas las muestras del primer experimento y para muestras seleccionadas para el segundo experimento (Tabla complementaria 3). Se secuenciaron dos réplicas para todas las muestras (cada réplica se obtuvo agrupando el ARN extraído de dos quesos diferentes). El ARN ribosómico (ARNr) se agotó con el kit Ribo-Zero Magnetic (Epicentre, Charlotte, Carolina del Norte) y el ARN enriquecido con ARNm se purificó con Agencourt RNAClean XP (Beckman Coulter, Milán, Italia) siguiendo las instrucciones del fabricante. Luego, la preparación de bibliotecas y la multiplexación de muestras se llevaron a cabo utilizando el kit de preparación de bibliotecas ScriptSeq v2 RNA-Seq (Epicentre, Charlotte, Carolina del Norte) (tamaño de inserción de alrededor de 300 pb). La calidad de la biblioteca fue verificada por 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, California). La secuenciación se llevó a cabo en un secuenciador Next Seq 500 con el kit de salida media (ambos de Illumina, San Diego, California), que produjo lecturas de un solo extremo de 150 pb.

Las lecturas de amplicón de ARNr 16S se analizaron utilizando el software QIIME 1.9.031, como se informó anteriormente30. Las OTU definidas por un 99 % de similitud se seleccionaron utilizando uclust pipeline32 y las secuencias representativas se enviaron al clasificador RDPII33 para obtener la asignación de taxonomía y la abundancia relativa de cada OTU utilizando la base de datos de genes Greengenes 16S rRNA34.

Todo el análisis de datos del metatranscriptoma se llevó a cabo de la siguiente manera: la calidad de las lecturas sin procesar (puntuaciones Phred) se evaluó mediante el kit de herramientas FastQC (http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/). La contaminación del adaptador y el cebador se eliminó con CutAdapt35. Luego, las bases de baja calidad (puntuación de Phred <20) se recortaron y las lecturas de menos de 60 pb se descartaron con el software SolexaQA++36. Las lecturas se alinearon con una base de datos de referencia utilizando Bowtie237 en modo sensible de extremo a extremo. La base de datos utilizada se construyó descargando las porciones de codificación de proteínas de los genomas (archivos .ffn) de la base de datos NCBI RefSeq (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/ASSEMBLY_BACTERIA/) y de http://patricbrc .org/portal/. Las especies incluidas se eligieron de acuerdo con los resultados de la secuenciación 16S y la selección de especies que se encuentran comúnmente en los ecosistemas alimentarios (enumerados en la Tabla complementaria 6). Como no realizamos metagenómica y no disponíamos de los genomas de las cepas aisladas directamente de esas muestras, se incluyeron todos los genomas secuenciados disponibles. Los archivos .ffn concatenados se alinearon con la base de datos de la Enciclopedia de genes y genomas de Kioto (KEGG)38, versión de abril de 2011, utilizando mblastx39 para obtener la anotación funcional y la taxonomía de genes. El número de lecturas asignadas de forma única a cada gen en la base de datos se extrajo mediante SAMtools40 y se normalizó de acuerdo con el tamaño de la biblioteca mediante scripts personalizados creados en el entorno R (www.r-project.org). Solo los genes a los que se asignaron al menos 5 lecturas/muestra se mantuvieron para análisis posteriores. El análisis estadístico y el trazado se llevaron a cabo en un entorno R. El análisis de expresión génica diferencial se realizó utilizando el paquete Bioconductor DESeq41. Los valores de p se ajustaron para pruebas múltiples utilizando el procedimiento de Benjamini-Hochberg42 y se consideró significativa una tasa de descubrimiento falso (FDR) <0,05. Las correlaciones de Spearman por pares entre OTU, genes KEGG, compuestos orgánicos volátiles e índices bioquímicos se calcularon utilizando el paquete R psych y las significativas (FDR < 0,05) se trazaron en una red correlativa utilizando Cytoscape v. 2.8.143. El análisis de componentes principales (PCA) y el agrupamiento jerárquico se llevaron a cabo utilizando el paquete made4 en R. Todos los resultados se informan como valores medios de dos réplicas.

La extracción de compuestos volátiles se realizó según Lee et al.44. El queso congelado se ralló finamente y se transfirieron 25 g a una botella de 100 mL, con 25 mL de agua desionizada, 50 μL de 2-metil-3-heptenona (99 % de pureza, Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri) como contenido interno. estándar (950 mg L−1) y 12,5 g de fosfato de sodio (NaH2PO4). La botella se mantuvo a 50 °C durante 10 min en un baño de agua para derretir el queso. Luego, el queso derretido se agitó magnéticamente durante 20 min a 50 °C para acelerar el equilibrio de los compuestos volátiles en el espacio de cabeza. La fibra SPME (50/30 μm de espesor de divinil-benceno/carboxeno/polidimetilsiloxano, 2 cm; Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri) se insertó a través de un septo de teflón en la botella y se expuso al espacio libre de la muestra durante 30 min a 40 ° C durante la agitación. Se informó que el mismo tipo de fibra es altamente eficiente para el análisis del aroma del queso45. Los compuestos volátiles se analizaron mediante GC acoplado con un espectrómetro de masas usando un GC/MS Hewlett-Packard 6890N (Agilent Technologies, Palo Alto, California) equipado con una columna capilar J&W HP-5MS (30 m × 0,25 mm id × 0, 25 μm de espesor de película; J&W Scientific, Folsom, California). La temperatura se fijó a 40 °C durante 2 min y se aumentó de 40 a 160 °C a razón de 6 °C/min y de 160 a 210 °C min−1 a 10 °C min−1. El inyector se mantuvo a 250 °C. Se utilizó helio como gas portador (0,9 mL min−1). Los espectros de masas se registraron a 70 eV. La temperatura de la fuente fue de 230 °C y la temperatura de la interfaz fue de 250 °C. La desorción térmica de compuestos volátiles se llevó a cabo exponiendo la fibra SPME en el inyector durante 10 min. La identificación de los compuestos se realizó comparando los tiempos de retención y los espectros de masas con los de los compuestos de referencia puros en las mismas condiciones y con los de la base de datos del NIST. Antes de su uso, la fibra se acondicionó a 270 °C durante 1 hora. Se realizó una prueba en blanco antes de cada análisis para evitar la liberación de compuestos indeseables. El análisis cuantitativo se realizó normalizando el área del pico de cada compuesto con respecto al área del pico del patrón interno. Las áreas de los picos fueron procesadas por el software Chemstation (Agilent Technologies, Palo Alto, California). El análisis se realizó por triplicado.

Se determinaron diferencias significativas entre las diferentes muestras para cada compuesto mediante análisis estadístico ANOVA de una vía. Se utilizó la prueba de Tukey para discriminar entre las medias de las variables. Las diferencias con P < 0,05 se consideraron significativas. La elaboración de los datos se llevó a cabo utilizando XLStat (versión 2009.03.02), un paquete de software complementario para Microsoft Excel (Addinsoft Corp., París, Francia).

Se dispersó queso rallado (5 g) en 100 mL de tampón de citrato de sodio 0,4 M (pH 8,0) previamente calentado a 40 °C y homogeneizado durante 1 min con un aparato Ultra-Turrax (Ultra-Turrax modelo T25, Ika Labortechnik, Staufen, Alemania). ). El grado de hidrólisis (DH) se determinó con el método del ácido 2,4,6-trinitrobencenosulfónico, según Hermanson46 con las modificaciones reportadas por Picariello et al.47. Para el análisis LC-MS, el pH de la fracción soluble en citrato se ajustó a 4,6. La suspensión resultante se centrifugó durante 10 min a 3000 g, se eliminó la capa de grasa y se separaron las fracciones insoluble y soluble. Luego, las dos fracciones se analizaron mediante LC/ESI-Q/TOF MS/MS utilizando un espectrómetro de masas híbrido Q TOF Ultima (Waters, Manchester, Reino Unido), equipado con una fuente ESI y que funciona en modo de iones positivos, como se informó anteriormente48.

El índice de lipólisis se expresó como la cantidad de KOH (en mg) necesaria para neutralizar los ácidos grasos libres contenidos en 1 g de muestra. Veinte gramos de cada muestra congelada fueron finamente rallados y tres gramos del queso rallado fueron incubados por 30 min con 50 ml de etanol/éter dietílico (1:1 v/v) mientras se agitaba para extraer la grasa. La suspensión se filtró a través de papel Watman n° 42 y la acidez del filtrado se midió por titulación según lo descrito por Dugat-Bony et al.16. Cada muestra se analizó por triplicado.

Las secuencias de 16S rRNA y metatranscriptoma están disponibles en Sequence Read Archive (SRA) del National Center for Biotechnology Information (NCBI) con los números de acceso SRP061555 y SRP061556, respectivamente.

Cómo citar este artículo: De Filippis, F. et al. La metatranscriptómica revela cambios funcionales impulsados por la temperatura en el microbioma que afectan la tasa de maduración del queso. ciencia Rep. 6, 21871; doi: 10.1038/srep21871 (2016).

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FDF fue apoyado por una subvención de Regione Campania dentro del programa "POR CAMPANIA FSE 2007/2013" - proyecto CARINA (Seguridad, sostenibilidad y competitividad de la producción agroalimentaria en Campania) - CUP B25B09000080007. Nos gustaría agradecer a la lechería Campolongo Srl, Montesano Sulla Marcellana – Italia por proporcionar las muestras para este estudio.

Departamento de Ciencias Agrícolas, Universidad de Nápoles Federico II, Via Università 100, Portici, 80055, Italia

Francesca De Filippis, Alessandro Genovese, Pasquale Ferranti y Danilo Ercolini

División de Biociencias (BIO), Laboratorio Nacional de Argonne, Argonne, IL, EE. UU.

jack a gilbert

Departamento de Ecología y Evolución, Universidad de Chicago, Chicago, IL, EE. UU.

jack a gilbert

Departamento de Cirugía, Universidad de Chicago, Chicago, IL, EE. UU.

jack a gilbert

Instituto de Genómica y Biología de Sistemas, Universidad de Chicago, Chicago, IL, EE. UU.

jack a gilbert

El Laboratorio de Biología Marina, Woods Hole, MA, EE. UU.

jack a gilbert

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FDF realizó los experimentos de 16S y metatranscriptómica y el análisis de datos y escribió el manuscrito. DE diseñó el estudio y contribuyó a la preparación del manuscrito. JAG contribuido al análisis de datos y preparación de manuscritos. AG y PF realizaron el análisis del metaboloma.

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

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De Filippis, F., Genovese, A., Ferranti, P. et al. La metatranscriptómica revela cambios funcionales impulsados por la temperatura en el microbioma que afectan la tasa de maduración del queso. Informe científico 6, 21871 (2016). https://doi.org/10.1038/srep21871

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Recibido: 22 de octubre de 2015

Aceptado: 02 febrero 2016

Publicado: 25 febrero 2016

DOI: https://doi.org/10.1038/srep21871

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