Resolviendo la sepsis

Nature Biomedical Engineering (2023)Citar este artículo

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La inmunoparálisis es una respuesta antiinflamatoria compensatoria y persistente al trauma, sepsis u otro insulto grave, que aumenta el riesgo de infecciones oportunistas, morbilidad y mortalidad. Aquí, mostramos que en monocitos humanos primarios cultivados, la interleucina-4 (IL4) inhibe la inflamación aguda, al mismo tiempo que induce una memoria inmune innata de larga duración llamada inmunidad entrenada. Para aprovechar esta característica paradójica de IL4 in vivo, desarrollamos una proteína de fusión de apolipoproteína A1 (apoA1) e IL4, que se integra en una nanopartícula lipídica. En ratones y primates no humanos, una nanopartícula de incrustación de apoA1-IL4 inyectada por vía intravenosa se dirige a órganos hematopoyéticos ricos en células mieloides, en particular, el bazo y la médula ósea. Posteriormente, demostramos que la nanoterapia con IL4 resolvió la inmunoparálisis en ratones con hiperinflamación inducida por lipopolisacáridos, así como en modelos de sepsis humana ex vivo y en endotoxemia experimental. Nuestros hallazgos respaldan el desarrollo traslacional de formulaciones de nanopartículas de apoA1-IL4 para el tratamiento de pacientes con sepsis en riesgo de complicaciones inducidas por inmunoparálisis.

La sepsis es una afección médica grave causada por una respuesta desregulada del huésped a la infección que, con frecuencia, provoca insuficiencia orgánica y muerte1. Como resultado de la incapacidad del sistema inmunitario para eliminar un patógeno, los pacientes con sepsis pueden experimentar simultáneamente características hiperinflamatorias e inmunosupresoras, lo que hace que esta afección sea extremadamente difícil de manejar2,3,4. Hasta 30 a 40 % de los pacientes con sepsis muestran un fenotipo predominante de inmunoparálisis. La inmunoparálisis se caracteriza por una respuesta inmunitaria innata antiinflamatoria persistente después de un insulto como la sepsis5, lo que pone a los pacientes en alto riesgo de infecciones recurrentes y secundarias, que con frecuencia conducen a disfunción orgánica y muerte6.

Las estrategias terapéuticas para reequilibrar las respuestas inmunitarias en la sepsis y mejorar los resultados de los pacientes a través de la inmunoterapia están en pañales. Un trabajo experimental reciente sugiere que la reprogramación a largo plazo de las células inmunitarias innatas7,8, un proceso denominado "inmunidad entrenada"9,10, puede revertir la tolerancia y la inmunoparálisis inducidas por una estimulación bacteriana exagerada11. Aunque la inmunidad entrenada inducida terapéuticamente12 es teóricamente una estrategia convincente para superar la inmunoparálisis, existe una necesidad crítica de enfoques que puedan traducirse de manera segura y eficiente a entornos clínicos.

En nuestra búsqueda para resolver simultáneamente la hiperinflamación y la inmunoparálisis, consideramos la interleucina-4 (IL4) para la modulación de la inmunidad y la tolerancia entrenadas. Al reevaluar los efectos directos informados de esta citocina en los monocitos in vitro13,14,15, descubrimos que, paradójicamente, la IL4 induce inmunidad entrenada además de sus conocidos efectos antiinflamatorios. Presumimos que las propiedades únicas de IL4 podrían implementarse para superar la inmunoparálisis en monocitos inducida por estimulación con endotoxina bacteriana (lipopolisacárido (LPS)). Sin embargo, debido a sus propiedades farmacocinéticas desfavorables y la amplia expresión del receptor de IL4 (IL4R), la IL4 natural es poco adecuada para regular terapéuticamente las células mieloides in vivo. Enrutar IL4 directamente al compartimento mieloide es, por lo tanto, una vía terapéutica atractiva. En apoyo de este concepto, desarrollamos una proteína de fusión de la apolipoproteína A1 (apoA1), la principal proteína constituyente de la lipoproteína de alta densidad, e IL4 y denominamos a esta construcción 'apoA1–IL4'16,17. La proteína de fusión apoA1-IL4 se integró fácilmente en nanopartículas de lípidos para generar nanopartículas de IL4 ávidas de células mieloides. Luego evaluamos el comportamiento de las nanopartículas de IL4 en ratones y primates no humanos utilizando imágenes de tomografía por emisión de positrones (PET) in vivo y conteo gamma cuantitativo ex vivo. Finalmente, estudiamos el potencial terapéutico de las nanopartículas de IL4 en inflamación traslacional múltiple y modelos de sepsis in vivo y ex vivo.

En el contexto de la inmunología de células mieloides, la IL4 se conoce principalmente por sus propiedades antiinflamatorias13,14,15. Por lo tanto, primero validamos varios efectos inhibitorios conocidos de IL4 sobre la inflamación en monocitos humanos primarios (Fig. 1a). Estimulamos monocitos enriquecidos con Percoll con LPS durante 24 h, en presencia o ausencia de IL4 (25 ng ml−1). Como se esperaba, la IL4 inhibió potentemente la secreción de las citoquinas proinflamatorias factor de necrosis tumoral (TNF) e IL6 (Fig. 1b). Curiosamente, las células tratadas con IL4 secretaron significativamente más IL-1Ra en comparación con los controles (Fig. 1b). Dado que la glucólisis aumenta en las células mieloides activadas18, medimos la producción de lactato en monocitos no estimulados tratados con IL4 o un control medio. Descubrimos que la IL4 reducía leve, pero significativamente, la producción de lactato inicial (datos ampliados, figura 1a), lo que confirma sus propiedades antiinflamatorias agudas.

a, Esquema de experimentos de inflamación directa in vitro. b, niveles de TNF, IL6 e IL1Ra después de 24 h de estimulación de monocitos primarios humanos. c, Esquema de experimentos de inmunidad entrenada in vitro. d, niveles de TNF e IL6 después de la reestimulación de células entrenadas con β-glucano. e, niveles de TNF e IL6 después de la reestimulación de células entrenadas con IL4. f, Análisis Seahorse del metabolismo glucolítico (izquierda) y mitocondrial (derecha) en células entrenadas con IL4. Los datos se presentan como media ± sd OCR, tasa de consumo de oxígeno; 2-DG, 2-desoxi-D-glucosa.

Sobre la base de estas propiedades antiinflamatorias, planteamos la hipótesis de que IL4 también podría inhibir la inducción de inmunidad entrenada (Fig. 1c). Para probar esta hipótesis, los monocitos se entrenaron con β-glucano, un estímulo de inmunidad entrenado prototípico, durante 24 h, seguido de lavado del estímulo y un período de descanso de 5 días en medio de cultivo. El día 6, volvimos a estimular las células con LPS durante otras 24 h y medimos TNF e IL6 (Fig. 1d). Si bien el β-glucano indujo la inmunidad entrenada como se esperaba, la adición de IL4 en las primeras 24 h no inhibió el efecto del entrenamiento (Fig. 1d). Contrariamente a nuestra hipótesis inicial, la exposición de monocitos a IL4 solo durante 24 h indujo un fenotipo de inmunidad entrenada en el día 6 (Fig. 1e). Además de una mayor producción de citocinas proinflamatorias, las células entrenadas con IL4 produjeron más lactato al inicio del estudio (datos ampliados, figura 1b). Además, las células entrenadas con IL4 fueron ligeramente menos efectivas para fagocitar Candida albicans muerta por calor que los controles no entrenados (Datos extendidos, Fig. 1c). Colectivamente, nuestros datos muestran que IL4 inhibe la inflamación e induce inmunidad entrenada, tanto a nivel inmunológico metabólico como funcional.

Alentados por estas observaciones, estudiamos exhaustivamente las alteraciones metabólicas que siguen a la inmunidad entrenada inducida por IL4. Con este objetivo, utilizamos análisis de flujo metabólico de Seahorse para investigar el metabolismo glucolítico y oxidativo de células entrenadas con IL4 y controles no estimulados. El entrenamiento con IL4 el día 0 tuvo un marcado efecto sobre los parámetros metabólicos medidos el día 6 (Fig. 1f), con una tendencia hacia una mayor glucólisis basal y un aumento significativo de la capacidad glucolítica máxima desencadenada por oligomicina (Fig. 1f, izquierda). Además, las tasas máximas de respiración activadas por el cianuro de p-trifluorometoxifenilhidrazona de carbonilo y la línea de base aumentaron significativamente con el entrenamiento con IL4 (Fig. 1f; derecha).

Luego usamos la citometría de flujo para medir varios parámetros comúnmente asociados con la activación de IL4 de monocitos y macrófagos (Datos extendidos Fig. 1d). El entrenamiento con IL4 provocó una fuerte regulación a la baja de la expresión del grupo de diferenciación (CD)14 el día 6. Por el contrario, CD200R y especialmente CD206 aumentaron significativamente el día 6 después de la activación de IL4 el día 0. El entrenamiento con IL4 aumentó marginalmente el CD80, pero en general la expresión era todavía baja en estos macrófagos por lo demás ingenuos. Se sabe que las células dendríticas derivadas de monocitos (moDC, que se diferencian usando IL4 + factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF)) también regulan negativamente CD14 mientras regulan fuertemente CD1c. Las células entrenadas con IL4 expresaron un poco más de CD1c que las células no entrenadas, pero mucho menos que las moDC (datos extendidos, Fig. 1e). Estos resultados indican que IL4 induce un programa de inmunidad entrenada que incorpora características conocidas de las funciones inmunológicas clásicas de IL4.

Los mecanismos de señalización de IL4 están bien descritos: el eje del sustrato del receptor de insulina 2-fosfoinositida 3-quinasas-mamífero objetivo de la rapamicina (IRS-2-PI3K-mTOR) y la vía de señalización del transductor de señal y activador de la transcripción 6 (STAT6)19 (Fig. .2a). Realizamos experimentos de inhibición farmacológica para investigar el papel de estas vías tanto para la inhibición de la inflamación aguda como para la inducción de inmunidad entrenada por IL4. La inhibición de PI3K o mTOR (usando wortmannin o torin-1, respectivamente) no anuló el efecto de IL4 en la inflamación aguda pero disminuyó las respuestas inmunitarias entrenadas (Fig. 2b, c y Datos extendidos Fig. 2a). El entrenamiento de IL4, medido por un aumento en la producción de TNF e IL6, se redujo significativamente en presencia de torin-1 (Fig. 2c y Datos extendidos, Fig. 2b). Por el contrario, el inhibidor de STAT6 AS1517499 restauró parcialmente la producción de citoquinas en las respuestas inflamatorias agudas, pero no afectó la inducción de inmunidad entrenada por IL4 (Fig. 2b, c). Por lo tanto, cada una de las vías de señalización inducidas aguas abajo del compromiso de IL4 con sus receptores tiene funciones distintas: IL4 ejerce su función antiinflamatoria aguda conocida a través de STAT6 pero simultáneamente induce inmunidad entrenada a través de PI3K-mTOR, un efecto proinflamatorio previamente desconocido.

a, Resumen esquemático de las principales vías de señalización de IL4 descritas anteriormente19. Generado usando Biorender. b, niveles de TNF e IL6 después de 24 h de estimulación de monocitos mientras se bloquean rutas de señalización clave de IL4. c, niveles de TNF e IL6 después de la reestimulación de células que fueron entrenadas con IL4 mientras bloqueaban rutas de señalización clave de IL4. d, Mapa de calor del transcriptoma de células entrenadas con IL4, antes y después de la reestimulación. e, análisis de enriquecimiento de motivos TF en inmunidad entrenada por IL4 (el mapa de calor indica puntuaciones z). f, Análisis de enriquecimiento de vías del transcriptoma de inmunidad entrenado por IL4. g, niveles de TNF e IL6 después de la reestimulación de células que fueron entrenadas con IL4 en presencia de un inhibidor de metiltransferasa SET7. CPH, ciproheptadina. h, análisis ChIP-qPCR AUC de TNF en células entrenadas con IL4. Los datos en gráficos de barras se presentan como media ± sd

Para obtener información sobre el programa molecular inducido por el entrenamiento con IL4, realizamos un análisis de transcriptómica en macrófagos ingenuos y entrenados con IL4, tanto antes como después de la reestimulación con LPS en el día 6. En general, 140 genes se indujeron más fuertemente ("regulados al alza") en Macrófagos entrenados con IL4, mientras que 249 genes se atenuaron (Fig. 2d). Entre los principales genes regulados al alza estaban las citoquinas proinflamatorias como IL6 e IL12B que se sabe que están involucradas en la inmunidad entrenada10. Entre los genes atenuados destacados estaban CCL19 y SOCS2, que son importantes para el tráfico de linfocitos y la supresión de la señalización de citoquinas, respectivamente20,21.

A continuación, realizamos un análisis de enriquecimiento del motivo del factor de transcripción (TF) (Fig. 2e) y análisis de ontología génica y enriquecimiento de la vía (Fig. 2f) para obtener más información sobre los perfiles del transcriptoma. Los promotores de genes sobrerregulados en macrófagos entrenados en IL4 estaban altamente enriquecidos en motivos reconocidos por TF, como el factor de transcripción activador (ATF) 2/ATF7, el receptor alfa activado por el proliferador de peroxisomas (PPARα) y STAT5, mientras que los motivos del factor regulador de interferón (IRF) eran especialmente agotado. Este patrón se invirtió principalmente para los genes no afectados y atenuados, excepto para la caja TATA, el factor nuclear potenciador de la cadena ligera kappa de las células B activadas (NFκB)-p65, NFκB-p65-Rel y el antígeno 2 relacionado con fos: estos motivos estaban altamente enriquecidos en promotores de genes atenuados, pero disminuyeron tanto en genes no afectados como regulados al alza (Fig. 2e). La ontología génica (proceso biológico (BP) y función molecular (MF)) y el enriquecimiento de la ruta de la Enciclopedia de genes y genomas de Kioto mostraron que las actividades inmunológicas estaban presentes en ambos procesos regulados al alza (por ejemplo, 'respuesta al organismo' de BP, Enciclopedia de genes y genomas de Kioto 'señalización de TNF') y conjuntos de genes atenuados (por ejemplo, 'respuesta inmunitaria' de BP, 'actividad de citoquinas' de MF) (Fig. 2f). Realizamos un análisis de transcriptoma similar en monocitos estimulados inmediatamente después del aislamiento con IL4, LPS o IL4 y LPS combinados, que confirmó una respuesta transcriptómica antiinflamatoria aguda a IL4 (Datos extendidos Fig. 2c-e). Juntos, estos datos revelan programas transcripcionales específicos tanto en los efectos antiinflamatorios agudos como en las respuestas inmunitarias entrenadas a largo plazo invocadas por IL4.

Posteriormente, investigamos la importancia y la presencia de la reprogramación epigenética, específicamente las modificaciones de histonas. La adición del fármaco antialérgico ciproheptadina, un inhibidor de histona metiltransferasa su(var)3-9, potenciador de zeste y tritórax que contiene lisina metiltransferasa 7 (SET7) (también conocido como SET9), anuló la inducción de inmunidad entrenada por IL4 (Fig. 2g). SET7 se ha descrito anteriormente como un importante mediador epigenético de la inmunidad entrenada22. Además, evaluamos la represión de TNF mediada por histona-3-lisina-9-trimetilación (H3K9me3) mediante análisis de PCR cuantitativa (qPCR) de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) en inmunidad entrenada inducida por IL4. El uso de un análisis del área bajo la curva (AUC) de seis pares de cebadores mostró una disminución de H3K9me3 en la inmunidad entrenada inducida por IL4, aunque esto no alcanzó significación estadística (Fig. 2h y Datos extendidos Fig. 2f). Juntos, estos datos indican que la reprogramación epigenética es crucial y característica de la inmunidad entrenada inducida por IL4.

A pesar de su capacidad para inhibir la inflamación aguda y, al mismo tiempo, inducir inmunidad entrenada, la traducción clínica de la IL4 recombinante se ve obstaculizada por sus propiedades farmacocinéticas desfavorables. Para superar esta limitación, desarrollamos una proteína de fusión basada en apoA1 que se integra fácilmente en nanopartículas lipídicas para producir nanopartículas que contienen IL4 (IL4-aNP). Las nanopartículas basadas en ApoA1 (aNP) se acumulan inherentemente en los órganos hematopoyéticos y se dirigen de manera eficiente a las células mieloides y sus progenitores16,23 (Fig. 3a). Específicamente, diseñamos una proteína de fusión que consiste en apoA1 humana e IL4 humana (apoA1-IL4) conectadas a través de un conector flexible y flanqueada por dos etiquetas de purificación, una etiqueta 6his ubicada en el extremo N-terminal y una etiqueta estreptocócica en el extremo C-terminal ( Figura 3b). Utilizamos técnicas de caracterización molecular para confirmar la naturaleza y pureza de apoA1–IL4. Al realizar electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE) en cada muestra de proteína purificada, confirmamos la presencia de proteína con pesos moleculares de 25 kDa (apoA1), 18 kDa (IL4) y 37 kDa (apoA1-IL4) ( Fig. 3c), mientras que los western blots indicaron la presencia de apoA1 e IL4 (Fig. 3d). Debido a su naturaleza anfifílica, la apoA1 y sus derivados se ejecutan más rápido durante la electroforesis en gel en comparación con proteínas de tamaño similar. Estas observaciones fueron corroboradas por espectrometría de masas (MS) de tiempo de vuelo (Q-ToF) de cuadrupolo que mostró un pico de masa único en 47 576,03 Da correspondiente a un peso molecular de 47 582,57 Da para apoA1-IL4 (Fig. 3e).

a, Resumen esquemático de la tecnología de proteínas de fusión basada en apoA1. b, Esquema de la estructura de la proteína de fusión apoA1-IL4. c,d SDS-PAGE (c) y western blot (d) de proteínas expresadas de forma recombinante. Anticuerpos específicos para IL4 y apoA1 endógenos. e, Cromatograma y espectro Q-ToF-MS de apoA1–IL4. f, Cinética de la unión de apoA1–IL4 a IL4Rα usando SPR. g, Activación de células HEK-Blue que expresan IL4Rα e IL13Rα1 por apoA1–IL4. Los datos se presentan como media ± SD de DMPC, 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina; GGS, glicina-glicina-serina; RU, unidades de resonancia.

Antes de integrar apoA1–IL4 en nanopartículas lipídicas, se realizaron análisis biofísicos y celulares, utilizando células indicadoras de resonancia de plasmón superficial (SPR) y HEK-Blue IL4/IL13 (HEK-IL4), para determinar la preservación de la actividad biológica después de la extracción, purificación y proceso de replegado. Determinamos las constantes de disociación de equilibrio KD de apoA1-IL4 contra el receptor alfa de IL4 humano (IL4Rα) usando SPR en 4.5 ± 1.1 nM (Fig. 3f). Las células HEK-IL4 poseen un gen informador inducible por IL4Rα/STAT6 que codifica la fosfatasa alcalina secretada (SEAP), que produjeron de manera destacada tras la introducción de apoA1–IL4 en sus pocillos de cultivo. Esto indica actividad biológica de apoA1-IL4 (Fig. 3g). Aunque la fusión con apoA1 alteró sustancialmente las propiedades biofísicas de IL4, permitiendo la integración en nanopartículas lipídicas, la unión a su receptor se conservó con una KD de 0,28 ± 0,1 nM (datos ampliados, figura 3a). En resumen, hemos desarrollado una proteína de fusión apoA1-IL4 que conserva las actividades biológicas de IL4 después de la extracción, purificación y replegamiento y contiene las características fisicoquímicas deseables para su integración en nanopartículas lipídicas a través de apoA1.

Para mejorar las propiedades farmacocinéticas de IL4 y su biodisponibilidad para las células mieloides, integramos la proteína de fusión apoA1-IL4 en nanopartículas lipídicas para producir IL4-aNPs16. Se obtuvieron nanopartículas de diferentes tamaños y morfologías variando las composiciones de las formulaciones (Fig. 4a). La formación de nanopartículas discoidales y esféricas se confirmó mediante microscopía electrónica de transmisión criogénica (cryo-TEM) (Fig. 4b). Además, analizamos el tamaño y la estabilidad de las nanopartículas en PBS durante 14 días utilizando la dispersión de luz dinámica (DLS) (Fig. 4c, d). Los IL4-aNP permanecen estables durante 14 días y tienen un tamaño y una estabilidad similares en comparación con nuestros aNP convencionales informados anteriormente (datos extendidos, Fig. 4a, b).

a,b, Representación esquemática (a) e imágenes crio-TEM (b) de IL4-aNP discoidales (panel superior) y esféricos (panel inferior). c, d, distribución de tamaño de IL4-aNP (c) y estabilidad (d) de IL4-aNP a lo largo del tiempo según lo determinado por DLS. El tamaño de IL4-aNP se informa como la media numérica. e, Imágenes de microscopía de fluorescencia de superresolución (dSTORM) de monocitos humanos incubados con apoA1(-IL4) o (IL4-)aNP marcados con fluorescencia (rojo) y teñidos con anticuerpo anti-IL4Rα (verde). La colocalización entre las proteínas e IL4Rα se puede apreciar en amarillo. Las regiones de interés blancas se amplían en las imágenes posteriores a la derecha. Los datos se presentan como media ± sd

A continuación, investigamos la interacción de IL4-aNP con monocitos humanos primarios. El análisis de microscopía de reconstrucción óptica estocástica directa (dSTORM) reveló la expresión de IL4Rα (verde) en la membrana. Además, la unión de apoA1 desnudo, apoA1-IL4 desnudo, aNP e IL4-aNP (rojo) se confirmó por el borde que cubre la superficie celular. Al enfocarnos en una sección ampliada de la membrana, encontramos que las apoA1–IL4 e IL4-aNP desnudas estaban asociadas con IL4Rα, formando co-clusters enriquecidos en la superficie celular, lo que no observamos para la apoA1 desnuda y las aNP convencionales (Figura 4e). Juntos, los ensayos de estabilidad de tamaño DLS, los análisis crio-TEM y dSTORM revelaron que la integración de la proteína de fusión apoA1-IL4 en nanopartículas lipídicas produce IL4-aNP biológicamente funcionales.

Para investigar la farmacocinética y la biodistribución en ratones C57BL/6, marcamos radiactivamente el componente proteico de cuatro tratamientos diferentes con IL4, a saber, IL4 desnuda, la proteína de fusión apoA1-IL4 desnuda e IL4-aNP discoidal y esférica, con circonio-89 (89Zr). Tenga en cuenta que estos experimentos se realizaron con la variante humana de IL4 que no muestra actividad biológica en ratones. La PET con tomografía computarizada (PET-CT) a las 24 h después de la administración intravenosa mostró que 89Zr-IL4 y 89Zr-apoA1-IL4 se acumularon principalmente en el riñón y el hígado. Por el contrario, además de acumularse en el hígado y el riñón, las 89Zr-IL4-aNP se acumularon en cantidades relativamente mayores en órganos ricos en células inmunitarias, incluidos el bazo y la médula ósea (Fig. 5a). Realizamos un conteo gamma ex vivo para determinar la vida media en sangre de los nanomateriales y la absorción en los órganos principales (Fig. 5b, c), que corroboramos mediante autorradiografía (Datos extendidos Fig. 5a). La comparación de los índices de absorción por órganos diana (médula ósea + bazo) divididos por órganos de eliminación (riñón + hígado) mostró un aumento significativo en el índice de absorción para las formulaciones de IL4-aNP en comparación con la proteína de fusión no formulada y la IL4 sola (datos ampliados, figura 5c). A continuación, utilizamos la citometría de flujo para medir la biodistribución específica del tipo de célula en los órganos diana. Las IL4-aNP discoidales marcadas con perclorato de 3,3′-dioctadeciloxacarbocianina (DiO) se acumulan en las células mieloides, sobre todo monocitos y neutrófilos, tanto en el bazo como en la médula ósea, mientras que no interactúan (o solo marginalmente) con los linfocitos (Fig. 5d). ). Sobre la base de su captación favorable (y mieloide específica) en los órganos hematopoyéticos, seleccionamos la formulación discoidal de IL4-aNP para estudios adicionales en primates no humanos y modelos traslacionales de inflamación y sepsis.

a, procesamiento de PET-CT a las 24 h después de inyectar construcciones marcadas con 89Zr. b, vida media en sangre del constructo marcado con 89Zr (n = 5, equipado con una función de descomposición de dos fases). DI, dosis inyectada. c, Recuento gamma ex vivo de tejidos 24 h después de la inyección del constructo marcado con 89Zr (n = 5), el número representa la relación entre el objetivo y los órganos de eliminación. d, Biodistribución específica del tipo de célula de IL4-aNP discoides marcadas con DiO en el bazo y la médula ósea, medida por citometría de flujo. e, vida media en sangre de 89Zr-IL4-aNP en primates no humanos. f, promedio de SUV de órganos a lo largo del tiempo en primates no humanos inyectados con 89Zr-IL4-aNPs (n = 2). g, promedio de SUV específico de órgano 48 h después de la inyección de 89Zr-IL4-aNPs en primates no humanos (n = 2). h, exploración PET-MRI de primate no humano 48 h después de la inyección de 89Zr-IL4-aNPs. Los datos se presentan como media ± sd cuando corresponda. DIO, perclorato de 3,3′-dioctadeciloxacarbocianina; MFI, intensidad de fluorescencia media; NHP, primate no humano.

Para evaluar la traducibilidad clínica de los inmunoterapéuticos de IL4-aNP, determinamos su biodistribución y perfil de seguridad en primates no humanos. A dos primates no humanos se les inyectó por vía intravenosa 89Zr-IL4-aNP. Su comportamiento in vivo se estudió utilizando PET tridimensional totalmente integrado combinado con imágenes de resonancia magnética (PET-MRI). Después de la inyección, la PET-MRI dinámica (datos extendidos Fig. 5d) mostró una rápida acumulación de IL4-aNP en el hígado, riñón (datos extendidos Fig. 5e), bazo y médula ósea (Fig. 5e-h). De acuerdo con los datos del ratón, no se observó una captación indeseable de IL4-aNP en órganos no objetivo, incluidos el cerebro y el corazón (Datos ampliados, Fig. 5b). Juntos, estos resultados muestran que la biodistribución favorable y el perfil de seguridad de IL4-aNP se mantienen en todas las especies, lo que corrobora el potencial traslacional de esta inmunoterapia.

Después de establecer que la IL4 natural amortigua simultáneamente las respuestas inflamatorias agudas e induce un programa de inmunidad entrenada, evaluamos los efectos de los efectos de IL4-aNP en los monocitos in vitro (Fig. 6a). Basamos la dosis para los experimentos in vitro en la eficiencia de la inducción de fosfo-STAT6 en monocitos humanos primarios, en relación con la IL4 desnuda (Datos ampliados, Fig. 6a). De hecho, las IL4-aNP (equivalente molar de 200 ng ml−1 de IL4 desnuda) redujeron significativamente la producción de TNF e IL6 de los monocitos estimulados por LPS (Fig. 6b), al tiempo que mejoraron la capacidad de respuesta a largo plazo de los monocitos en el día 6 (Fig. 6c) . Estos datos indican que las IL4-aNP, de manera similar a la IL4, suprimen la inflamación aguda e inducen inmunidad entrenada in vitro. Aunque los datos de biodistribución in vivo muestran que las IL4-aNP se dirigen específicamente a las células mieloides (Fig. 5d), la inmunidad entrenada inducida por IL4 cambia la expresión del marcador de superficie de los macrófagos, que son células presentadoras de antígeno (Datos extendidos Fig. 1d, e). Esto, a su vez, podría afectar las señales de polarización durante la activación de las células T. Para investigar estos posibles efectos indirectos de IL4-aNP en las células T, se cultivaron células T vírgenes alogénicas en presencia de macrófagos entrenados con IL4. En este modelo, el desajuste del antígeno leucocitario humano provoca la activación y polarización de las células T inespecíficas del antígeno. No se observaron diferencias significativas en la abundancia de los subtipos de células T, Th1 (CD4+ IFNγ alto), Th2 (CD4+ IL4+), células Treg (CD4+ IL10+), Th17 (CD4+ IL17+) y células T citotóxicas (CD8+ Granzyme B+ Perforin+) entre macrófagos entrenados y controles (Datos extendidos Fig. 6d). Juntos, estos hallazgos indican que el entrenamiento de IL4 no muestra la capacidad de sesgar las respuestas de las células T indirectamente, lo que sugiere un efecto predominantemente específico de mieloide.

a, Resumen esquemático de los experimentos de inflamación directa e inmunidad entrenada in vitro. b. Niveles de TNF e IL6 después de 24 h de estimulación de monocitos en presencia de IL4-aNP. c, niveles de TNF e IL6 después de la reestimulación de células entrenadas con IL4(-aNP). d, Resumen esquemático del modelo de tolerancia in vivo murino, incluida la nanoterapia con IL4. e, Niveles séricos de TNF e IL6 después de la reexposición a LPS de ratones tratados con IL4m-aNP. Para las comparaciones estadísticas se utilizó la prueba U de Mann-Whitney. f, Resumen esquemático del modelo de endotoxemia experimental humana, incluida la reversión de la tolerancia ex vivo. g, niveles de TNF e IL6 después de la reestimulación ex vivo de células toleradas por LPS in vivo humanas. h, TNF e IL6 se multiplicaron después de la reestimulación ex vivo de células toleradas por LPS in vivo humanas. Los datos se presentan como media ± sd

Los pacientes con sepsis pueden experimentar respuestas hiperinflamatorias e inmunoparálisis, creando una paradoja terapéutica. En teoría, la inducción de inmunidad entrenada se puede utilizar para revertir la tolerancia inmunológica, pero esto no se ha traducido a modelos in vivo11. Una razón es que la IL4 humana no muestra actividad biológica en ratones. Por lo tanto, diseñamos y producimos una proteína de fusión quimérica, que consiste en apoA1 humana e IL4 murina para la formulación con lípidos para producir IL4m-aNP. Aquí investigamos si IL4m-aNPs puede revertir la tolerancia inducida por LPS en ratones. Para ello, inyectamos por vía intraperitoneal LPS (0,1 mg kg−1) a ratones C57B/6 para inducir inmunoparálisis o PBS (como control). Administramos IL4m-aNPs por vía intravenosa (200 µg por dosis) a las 24 hy 48 h después del tratamiento con LPS. Volvimos a desafiar a los ratones con otra inyección intraperitoneal de LPS (0,1 mg kg-1) 72 h después del primer desafío (Fig. 6d). A pesar de las limitaciones en el tamaño del efecto, el tratamiento con IL4m-aNP mejoró las respuestas inmunitarias innatas como lo indica el aumento estadísticamente significativo (P = 0,0079) de las concentraciones séricas de IL6 después de la reexposición a LPS de ratones tolerados (Fig. 6e). Si bien las concentraciones de TNF en algunos ratones también estaban claramente elevadas, no se logró la significación estadística (P = 0,1508) debido a la heterogeneidad en la respuesta terapéutica (Fig. 6e). En conjunto, nuestros datos in vitro e in vivo muestran que los inmunoterápicos de IL4-aNP pueden reducir la tolerancia.

Después de observar la reversión de la tolerancia en el modelo de ratón, corroboramos estos resultados con un modelo que imita más de cerca la inmunoparálisis clínica humana. Obtuvimos sangre de individuos sanos que se sometieron a endotoxemia humana experimental, un modelo controlado estandarizado de inflamación sistémica que captura las características de los fenotipos de sepsis hiperinflamatorios e inmunoparalíticos (Fig. 6f). En este modelo humano controlado, el LPS se administra por vía intravenosa a voluntarios sanos, lo que provoca una respuesta inflamatoria sistémica seguida de tolerancia de los monocitos circulantes, un fenómeno que también se observa en la inmunoparálisis inducida por sepsis. Se recogió sangre antes y 4 h después del comienzo de la administración de LPS. Los monocitos aislados después de la administración de LPS mostraron una producción deficiente de citocinas tras la reexposición inmediata a LPS, lo que indica tolerancia (Datos ampliados, Fig. 6b). Cuando los monocitos tolerantes de los voluntarios expuestos a LPS se expusieron ex vivo a IL4 o IL4-aNP durante 24 h, mostraron una producción significativamente mejorada de TNF, pero no de IL6, tras la reestimulación con LPS en el día 3 (Fig. 6g (concentración) y 6h (cambio de pliegue) y datos extendidos Fig. 6c). Por el contrario, los monocitos no tratados permanecieron completamente tolerantes. Juntos, estos datos resaltan la capacidad de IL4 e IL4-aNP para revertir al menos parcialmente la tolerancia a LPS ex vivo.

En general, se considera que la IL4 es una citocina antiinflamatoria, aunque sus efectos a largo plazo sobre la función de los monocitos y los macrófagos no están claros15,24,25,26. Inicialmente, esperábamos que IL4 inhibiera la inmunidad entrenada, de manera similar a IL37 e IL38 (refs. 27, 28). Además de sus efectos inhibitorios conocidos sobre la inflamación aguda, observamos que IL4 induce inmunidad entrenada según lo evaluado por una mayor capacidad de respuesta a la producción de citoquinas. Mientras que la inducción de inmunidad entrenada por IL4 fue inesperada, nuestras observaciones están en línea con la activación de la cascada de señalización de mTOR por IL4, un mecanismo central en la inmunidad entrenada 10, 29. Posteriormente investigamos el efecto a largo plazo de la preexposición a IL4, así como la capacidad de IL4 para revertir la tolerancia inmune inducida por la endotoxemia experimental.En este contexto, los resultados muestran que un programa celular antiinflamatorio dependiente de STAT6 domina durante la exposición aguda de las células a IL4, pero que esto cambia con el tiempo hacia un programa impulsado por mTOR programa de inmunidad entrenada a largo plazo El entrenamiento de IL4 muestra características típicamente atribuidas a la inmunidad entrenada, incluida una mayor producción de citocinas, reconexión epigenética, mayor actividad metabólica y respuestas transcriptómicas alteradas tras la reestimulación. Estas observaciones están en línea con la creciente evidencia de un modelo de diferenciación de monocitos dependiente de la dinámica y el tiempo, como el propuesto en la ref. 30

La capacidad de IL4 para suprimir simultáneamente la inflamación aguda mientras induce un programa de inmunidad entrenado, que se ha informado que mejora la defensa del huésped10, puede usarse potencialmente para tratar infecciones graves. Por ejemplo, tanto la sepsis como la enfermedad por coronavirus 2019 (ref. 31) se caracterizan por una respuesta inmunitaria desregulada, lo que crea una paradoja terapéutica que requiere controlar las respuestas hiperinflamatorias y mejorar las respuestas de defensa del huésped contra infecciones secundarias (oportunistas). Para aprovechar estas características de IL4, desarrollamos una estrategia de ingeniería de proteínas de nanopartículas, superando así las propiedades farmacocinéticas in vivo desfavorables de esta citocina. Por lo tanto, intercambiamos la potencia reducida de IL4 de la proteína de fusión, una característica que se puede mejorar en estudios futuros al optimizar la proteína y el sistema de expresión como hicimos con la proteína de fusión quimérica, en beneficio de una biodisponibilidad y una farmacocinética sustancialmente mejoradas. Mostramos que la estrategia de aNP altera favorablemente la vida media en sangre y el perfil de biodistribución de IL4, lo que resulta en una acumulación elevada específica de neutrófilos y monocitos en órganos ricos en células mieloides como la médula ósea y el bazo, como se observó anteriormente en modelos de inmunidad entrenada32. Además, estos estudios han demostrado que las aNP que consisten en 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC), colesterol y apoA1 no inducen inmunidad entrenada, lo que enfatiza que nuestros hallazgos están estrictamente relacionados con el efecto biológico de IL4 ( referencia 33). Mientras estudiamos la biodistribución de aNP que contienen apoA1-IL4 humana, también desarrollamos la variante murina IL4m-aNP para evaluar la eficacia in vivo. De hecho, mostramos que IL4m-aNPs puede revertir parcialmente la inmunoparálisis en un modelo de ratón con sepsis inducida por LPS. Aunque los datos muestran respuestas inmunitarias innatas restauradas, con un aumento sustancial de la producción de IL6 y una clara tendencia hacia el aumento de las concentraciones de TNF en el suero de ratones tratados con IL4m-aNP, se requieren estudios completos de búsqueda de rango de dosis para expandir el potencial de la terapia con IL4-aNP en una variedad de enfermedades inmunomediadas que se caracterizan por hiperinflamación e inmunoparálisis concurrentes. Es alentador que, utilizando la proteína de fusión humana, mostramos que las IL4-aNP pueden revertir la tolerancia inmunitaria de las células adquiridas de un modelo humano que imita la inmunoparálisis clínica.

Anticipamos que la tecnología de nanopartículas de citoquinas puede encontrar usos en otras aplicaciones dirigidas a mieloides. El estado de inmunoparálisis no es exclusivo de la sepsis. Podrían considerarse aplicaciones inmuno-oncológicas, porque el cáncer también se caracteriza por una inflamación protumoral local y la supresión simultánea de las respuestas antitumorales (a menudo mediadas por células mieloides)34. El infarto de miocardio y el accidente cerebrovascular también se caracterizan por una inflamación estéril seguida de inmunoparálisis35,36, y los pacientes con traumatismos severos sufren una condición inmunoparalítica similar37. En todas estas situaciones, reducir la inflamación y superar la inmunoparálisis puede ser beneficioso para la recuperación del paciente y prevenir infecciones secundarias. La tecnología IL4-aNP podría convertirse en una modalidad terapéutica para el tratamiento de todas estas condiciones.

Se obtuvo sangre entera con capa leucocitaria (Sanquin) o EDTA de voluntarios sanos después de obtener el consentimiento informado por escrito. El material se diluyó al menos 1:1 con PBS sin calcio ni magnesio (Lonza) y se colocó en capas sobre Ficoll-Paque (GE Healthcare). Se usó centrifugación en gradiente de densidad durante 30 min a 615 g para separar la interfase de células mononucleares de sangre periférica (PBMC). Después de tres a cinco lavados con PBS frío, se evaluaron el rendimiento y la composición de PBMC utilizando un hemoanalizador (XN-450; Sysmex).

Los monocitos seleccionados negativamente se obtuvieron usando MACS, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (kit de aislamiento de monocitos MACS Pan, humano; Miltenyi Biotec). El rendimiento y la pureza de los monocitos se evaluaron en un hemoanalizador Sysmex.

Para algunos experimentos (indicados en el texto), los monocitos se enriquecieron alternativamente a partir de PBMC mediante centrifugación en gradiente de densidad hiperosmótica sobre Percoll (Sigma-Aldrich). Aproximadamente 150–200 × 106 PBMC se colocaron en capas sobre una solución de Percoll hiperosmótica (48,5 % v/v de Percoll, 0,16 M NaCl, en agua estéril) y se centrifugaron durante 15 min a 580 g, temperatura ambiente (RT). La interfase se recogió, se lavó una vez con PBS frío y se resuspendió en RPMI.

Todos los monocitos y macrófagos humanos primarios se cultivaron en RPMI-1640 con modificaciones holandesas (Invitrogen), que se complementó con GlutaMAX (2 mM; GIBCO), piruvato de sodio (1 mM; GIBCO) y gentamicina (50 μg ml−1; Centrafarm) . Este medio se conoce además como RPMI+++. Además, se añadió suero humano combinado al 10 % (v/v) al medio durante el cultivo celular (también denominado "medio de cultivo celular").

Para inducir inmunidad entrenada en monocitos humanos primarios se utilizó un método previamente optimizado y publicado38,39. Brevemente, los monocitos se adhirieron a una placa de cultivo celular de fondo plano durante 1 h y se lavaron con PBS tibio para eliminar las células no adherentes y los restos celulares. Luego, fueron estimulados ("entrenados") durante 24 h con uno de los estímulos detallados en la Tabla complementaria 1, o solo con medio (control "no entrenado").

Para los experimentos de inhibición farmacológica, los monocitos se preincubaron durante 1 h con uno de los inhibidores descritos en la Tabla complementaria 2 antes de agregar el estímulo de entrenamiento.

Después de la estimulación inicial de 24 h, las células se lavaron con PBS tibio y se añadió medio de cultivo celular tibio. A continuación, se permitió que los monocitos reposaran y se diferenciaran en macrófagos durante 5 días. El día 6 se evaluó la inducción de inmunidad entrenada. Con este fin, las células se volvieron a estimular típicamente con LPS durante 24 h adicionales para provocar la producción de citoquinas. Los sobrenadantes se recolectaron y almacenaron a -20 °C hasta su posterior análisis.

Para la mayoría de los otros métodos de lectura de inmunidad entrenados, las células se recolectaron de la siguiente manera: primero, las células se incubaron en reactivo de disociación celular Versene (Life Technologies) durante 30 minutos en una incubadora de cultivo celular. Luego se usó un raspador de células para retirar las células de las placas de cultivo. Para maximizar el rendimiento, las placas de cultivo se rasparon por segunda vez después de agregar PBS enfriado con hielo. Los macrófagos se centrifugaron durante 10 min a 300 g, 4 °C y se contaron antes de continuar con las aplicaciones posteriores.

Para los experimentos en los que se compararon las moDC con los macrófagos (control no entrenado o entrenado con IL4), las moDC se diferenciaron de la siguiente manera. En primer lugar, se obtuvieron monocitos seleccionados negativamente como se describe anteriormente. Después de 1 h de adherencia y un lavado con PBS, se cultivaron en RPMI+++ con HPS al 10 %, complementado adicionalmente con IL4 (25 ng ml−1) y GM-CSF (1000 UI ml−1; grado premium, Miltenyi Biotec). Las células se diferenciaron hasta el día 6, con una actualización del medio el día 3. El día 6, se recogieron las células no adherentes además de las células adherentes (como se describe anteriormente). Las moDC y los macrófagos luego se sometieron a análisis por citometría de flujo como se describe a continuación.

Ocho voluntarios masculinos sanos (confirmado por la historia clínica, el examen físico y las pruebas de laboratorio de rutina) con edades que oscilan entre los 18 y los 35 años dieron su consentimiento informado por escrito para participar en experimentos experimentales de endotoxemia realizados en la unidad de investigación del departamento de cuidados intensivos de Radboud. Centro Médico Universitario. Todos los procedimientos del estudio fueron aprobados por el comité de ética local (CMO Arnhem-Nijmegen (Radboudumc), números de registro NL71293.091.19 y 2019-5730) y se realizaron de acuerdo con la última versión de la declaración de Helsinki.

Se utilizó un régimen de infusión continua de endotoxinas, como se describe en detalle en otra parte40. En resumen, los participantes fueron admitidos en la unidad de investigación y se canularon una vena antecubital y una arteria radial para permitir la administración de líquidos y endotoxinas, y la toma de muestras de sangre y el seguimiento hemodinámico, respectivamente. Se registró continuamente un ECG de 3 derivaciones durante todo el experimento. Después de la prehidratación isoosmolar (1,5 l de NaCl al 0,45 % y glucosa al 2,5 % administrada por vía intravenosa en la hora anterior al inicio de la infusión de endotoxina), los voluntarios fueron desafiados por vía intravenosa con una dosis de carga de 1 ng kg−1 de endotoxina de peso corporal (lipopolisacárido de Escherichia coli (LPS) tipo O113, lote n.º 94332B1; List Biological Laboratories), seguida directamente de una infusión continua de 0,5 ng kg−1 h−1 durante 3 h. Los participantes fueron monitoreados durante 8 h después de la dosis de carga de endotoxina, después de lo cual fueron dados de alta de la unidad de investigación.

Para este proyecto, se obtuvieron muestras de sangre en dos momentos: 1 h antes y 4 h después de la administración de la dosis de carga. Los monocitos seleccionados negativamente se adquirieron como se describe anteriormente. Las células se adhirieron y se estimularon durante 24 h con IL4 humana recombinante, IL4-aNP discoidales, LPS (para evaluar la tolerancia inmunológica inicial) o medio solo (como control). Después de un lavado con PBS, las células se dejaron reposar en medio de cultivo durante 48 h y se volvieron a estimular con LPS durante 24 h más. Los sobrenadantes se recolectaron y almacenaron a -20 °C.

Se midieron TNF, IL6 e IL1Ra en sobrenadantes de cultivos celulares utilizando kits ELISA duoset (R&D Systems), según las instrucciones del fabricante. Para las mediciones de lactato, se utilizó un ensayo fluorométrico. Se añadieron aproximadamente 30 µl de muestra, medio de control o estándar conocido a una placa negra de 96 pocillos. Luego, se agregaron 30 µl de la mezcla de reacción (PBS pH 7,4, peroxidasa de rábano picante (0,2 U ml−1), lactato oxidasa (2 U ml−1), rojo Amplex (100 µM; Fisher Scientific)) y la mezcla de reacción se incubado durante 20 min en la oscuridad a temperatura ambiente. Inmediatamente después, se midió la fluorescencia a 530/25 nm y 590/35 nm. Se utilizó el software Gen5 (v3.03, BioTek) junto con Microsoft Excel para calcular las concentraciones de citoquinas y lactato en las muestras originales.

Los macrófagos se recogieron como se describe anteriormente y se transfirieron a una placa de 96 pocillos con fondo en V para la tinción. Las células se centrifugaron a 400 g durante 5 min a 4 °C. Se eliminó el sobrenadante y las células se lavaron una vez con 200 µl de PBA (PBS pH 7,4, 1 % p/v de BSA (Sigma)).

Los receptores Fc se bloquearon mediante incubación en PBS complementado con una mezcla de suero humano al 10 % durante 15 min a 4 °C. Después de lavar una vez más, los marcadores de superficie y la viabilidad se tiñeron en un volumen de 50 µl durante 30 min a 4 °C, utilizando los anticuerpos y el colorante de viabilidad descritos en la Tabla complementaria 3. Después de dos lavados, las células se resuspendieron en 150 µl. PBA y medido en un citómetro de flujo Cytoflex (Beckman Coulter) o sistema BD FACSVerse (BD Biosciences). La compensación se realizó utilizando perlas de compensación VersaComp (Beckman Coulter) para tinciones de anticuerpos únicos; se usó una mezcla de células vivas y muertas por calor para tinciones individuales del colorante de viabilidad (según las recomendaciones del fabricante). El análisis de datos se realizó en Flowjo (v10.7.1, BD Biosciences). Nuestra estrategia de selección fue la siguiente: primero, se utilizó una puerta de tiempo si era necesario. Luego, los eventos de una sola celda se seleccionaron utilizando las puertas posteriores FSC-A/SSC-A y FSC-A/FSC-H. Las células muertas se eliminaron del análisis seleccionando la población negativa para el colorante de viabilidad. Las intensidades de fluorescencia medias geométricas se calcularon como una medida de la expresión del marcador de superficie.

Para los experimentos de reacción de linfocitos mixtos, los macrófagos recolectados se usaron para ensayos de polarización de células T posteriores. Se sembraron células T vírgenes alogénicas con macrófagos en una proporción de 10 células T por cada macrófago. Las células se cultivaron en placas de 96 pocillos de fondo plano durante 7 días en medio de cultivo celular estándar. En este modelo, el desajuste del antígeno leucocitario humano provoca una activación no específica del receptor de células T. El último día, las células se estimularon con forbol 12-miristato 13-acetato (25 ng ml-1) + ionomicina (0,5 µg ml-1) durante 4 h en presencia de 100 ng ml-1 de Brefeldin A, un ' tapón de Golgi'. Las células se recolectaron y se dividieron en dos paneles de anticuerpos de citometría de flujo (uno para células T CD4 y otro para CD8; consulte también la Tabla complementaria 3). Las células se tiñeron de manera similar a la descrita anteriormente, con un paso adicional para la permeabilización de las células T para permitir la tinción de citoquinas intracelulares. Esto se realizó utilizando el conjunto de tampones fix and perm (eBioscience), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La estrategia de activación fue similar a la descrita anteriormente, con la adición de una selección para eventos positivos para CD3. Se calculó el porcentaje de células positivas para las citoquinas distintivas de la polarización de células T para estimar las proporciones del subconjunto de células T.

Los monocitos se estimularon con RPMI, IL4 o diferentes concentraciones de IL4-aNP (indicadas en Datos extendidos Fig. 6a) durante 20 min a 37 ° C. Las células se transfirieron a una placa de 96 pocillos con fondo en V y se mantuvieron en hielo durante el procedimiento de tinción. Después de teñir la viabilidad y CD14 (de la manera descrita anteriormente), las células se fijaron y permeabilizaron utilizando el juego de tampones fix and perm (eBioscience) durante 45 min a 4 °C en la oscuridad. Las células se lavaron dos veces con tampón permanente y se incubaron durante la noche en metanol absoluto enfriado en congelador a -20 °C. Después de dos lavados más en tampón permanente, las células se tiñeron para fosfo-STAT6 usando el anticuerpo descrito en la Tabla complementaria 3, durante 45 min a 4 ° C en la oscuridad. Las células se lavaron dos veces más en tampón permanente y finalmente se resuspendieron en PBA para su adquisición en el citómetro Cytoflex. La estrategia de selección fue muy similar a la del marcador de superficie de macrófagos con la adición de una selección para eventos positivos para CD14.

Los macrófagos se recolectaron como se describe anteriormente y se incubaron a 37 ° C durante 1 h con C. albicans marcado con FITC (amablemente proporcionado por M. Jaeger, Radboudumc) a una MOI de 1: 5. Las células se lavaron dos veces con PBA enfriado con hielo y se mantuvieron en hielo para detener la fagocitosis. Las células se tiñeron para CD45 (Tabla complementaria 3) durante 30 minutos en la oscuridad a 4 ° C. Después de dos lavados, se añadió azul de tripán hasta una concentración final de 0,01 % para extinguir FITC-Candida extracelular. A continuación, las células se adquirieron en un citómetro de flujo Cytoflex.

Durante el análisis de datos, los eventos CD45+ se seleccionaron primero para eliminar los eventos exclusivos de Candida. A continuación, se seleccionaron células individuales como se ha descrito anteriormente y se calculó el porcentaje de macrófagos positivos para Candida-FITC en cada muestra.

Los macrófagos se recogieron como se describe anteriormente. Las células se volvieron a suspender en RPMI+++ y se sembraron en cartuchos calibrados durante la noche a 105 células por pocillo. Después de adherirse durante 1 h, el medio se cambió a medio de ensayo (Agilent; ver más abajo) y las células se incubaron durante 1 h a 37 °C en niveles ambientales de CO2. Las tasas de consumo de oxígeno y las tasas de acidificación extracelular se midieron como sustitutos del metabolismo glucolítico y mitocondrial, utilizando un kit de prueba de estrés de glucólisis Seahorse XF o un kit de prueba de estrés de células Mito Seahorse XF (ambos Agilent; mediciones realizadas de acuerdo con las instrucciones del fabricante).

Los monocitos o macrófagos se lisaron en tampón RLT (Qiagen) y se almacenaron a -80 °C. Las extracciones de ARN se realizaron utilizando minicolumnas RNeasy (Qiagen) con tratamiento con ADNasa I en columna (sin ARNasa; Qiagen). El control de calidad preliminar y las mediciones de concentración se realizaron utilizando un aparato Nanodrop. Las muestras se enviaron al Instituto del Genoma de Beijing (BGI Dinamarca) para la secuenciación de ARN utilizando la plataforma DNBseq.

Para inferir los niveles de expresión génica, las lecturas de secuenciación de ARN se alinearon con el transcriptoma humano hg19 utilizando Bowtie (v1.2)41. La cuantificación de los niveles de expresión génica como RPKM se realizó mediante MMSEQ (v1.0.10)42. Las lecturas y las transcripciones se normalizaron utilizando DEseq2 y se realizaron comparaciones por pares. Los genes expresados ​​​​diferencialmente se identificaron utilizando DEseq2 (v1.34.0) con un cambio de pliegue> 2 y P <0.05, con un RPKM medio> 1 (ref. 43). Para identificar los genes que aumentaron o fueron atenuados por el entrenamiento con IL4, los macrófagos RPMI-d6 e IL4-d6 se compararon con muestras de RPMI-d6+LPS e IL4-d6+LPS, respectivamente. Las listas de genes se fusionaron y clasificaron sobre la base de IL4-d6+LPS/RPMI-d6+LPS. La ontología génica y el análisis de motivos TF se realizaron en promotores de genes utilizando la herramienta HOMER findMotifs (v4.11)44.

Los macrófagos se recogieron como se describe anteriormente y se resuspendieron en RPMI+++. Las células se fijaron durante 10 min en formaldehído libre de metanol al 1%. A continuación, la reacción se inactivó durante 3 min mediante la adición de glicina 125 mM. Las células fijadas se lavaron tres veces con PBS enfriado con hielo, se lisaron a aproximadamente 15 × 106 células por ml en tampón de lisis (HEPES 20 mM pH 7,6, SDS al 1 %, 1 × cóctel inhibidor de proteasa (Roche)), se sonicaron (Bioruptor Pico , Diagenode) y centrifugado (10 min, 16.060 g, a temperatura ambiente).

Las alícuotas de cromatina se desentrecruzaron en tampón TBE 0,5x (suplementado con 0,5 mg ml−1 de proteinasa K (Qiagen)) durante 1 h a 65 °C y se corrieron en un gel de agarosa al 1 % para confirmar el tamaño del fragmento objetivo de 200–800 pb.

La cromatina restante se dividió en ChIP y muestras de entrada. Las muestras de ChIP se diluyeron 10 veces en tampón de dilución (Tris 16,7 mM, pH 8,0, Triton al 1,0 %, EDTA 1,2 mM, NaCl 167 mM, 1 cóctel de inhibidores de proteasa en Milli-Q) y 1 µg de anticuerpo de grado ChIP (Diagenode) fue añadido. Las muestras se rotaron durante la noche a 4 °C.

Las perlas magnéticas de proteína A/G (Dynabeads) se lavaron dos veces en tampón de dilución suplementado con SDS al 0,15 % y BSA al 0,1 %. Las perlas lavadas se agregaron a las muestras de ChIP y se rotaron a 4 °C durante 1 hora. La cromatina unida a las perlas se lavó posteriormente (rotación durante 5 min, 4 °C) de la siguiente manera: una vez con tampón de lavado bajo en sal (20 mM Tris pH 8,0, 1,0 % Triton, 0,1 % SDS, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl en Milli-Q), dos veces con tampón de lavado alto en sal (igual que el tampón de lavado bajo en sal pero con NaCl 500 mM) y dos veces con tampón de lavado sin sal (Tris 20 mM pH 8,0, EDTA 1 mM, en Milli -Q). La cromatina se eluyó de las perlas en tampón de elución (NaHCO3 0,1 M, SDS al 1 %, en Milli-Q) durante 20 min, a temperatura ambiente. Las muestras de entrada se diluyeron 12 veces en tampón de elución. Después de la adición de NaCl (0,2 M) y proteinasa K (0,1 mg ml−1), todas las muestras se desentrecruzaron durante al menos 4 h en un bloque de calor con agitación (65 °C, 1000 rpm). Se usaron columnas de purificación MinElute PCR (Qiagen) para purificar fragmentos de ADN. Los fragmentos de ADN se almacenaron a 4 °C hasta el análisis posterior por qPCR.

El análisis de qPCR para las muestras y entradas de ChIP se realizó de la siguiente manera. Se usó el método verde SYBR para realizar qPCR con los cebadores detallados en la Tabla complementaria 4. Se usó un método Ct comparativo para comparar ChIP con las muestras de entrada y calcular la abundancia relativa en una región de control negativo. GAPDH y la región no traducida de ZNF se usaron respectivamente como controles negativos y positivos para H3K9me3. El TNF se interrogó utilizando seis pares de cebadores para el análisis de AUC como se describió anteriormente45.

ClearColi BL21 (DE3) (Lucigen) se transformó con un vector de expresión pET20b(+)apoA1–IL4. Las bacterias transformadas se inocularon en 40 ml de caldo de lisogenia (Sigma-Aldrich) suplementado con 100 μg l-1 de ampicilina y se cultivaron durante la noche a 37 °C. Posteriormente, el cultivo de toda la noche se inoculó en medio 2YT (16 g l-1 de peptona, 10 g l-1 de extracto de levadura y 10 g l-1 de NaCl) suplementado con 100 µg l-1 de ampicilina y se dejó crecer a 37 °C. En el punto en que la absorbancia a 600 nm alcanzó >1,5, se añadió isopropil β-d-tiogalacopiranósido 1,0 mM para inducir la expresión de pET20b(+)apoA1–IL4, y las células se incubaron durante la noche a 20 °C. Las células se recogieron por centrifugación antes de la preparación de los lisados ​​y la purificación.

Las células ClearColi que expresan la proteína de fusión ApoA1-IL4 se recogieron mediante centrifugación a 10.880 gy 4 °C durante 10 min. Las células recolectadas se resuspendieron en PBS y se centrifugaron a 3500 g y 4 °C durante 15 min. Las células se lisaron utilizando 20 ml de reactivo de extracción de proteínas BugBuster (Merck) y 20 µl de nucleasa Benzonase (Merck) por litro de cultivo en un agitador durante 30 min a temperatura ambiente. Los lisados ​​celulares se centrifugaron a 39 000 gy 4 °C durante 30 min. Los sedimentos insolubles se lavaron con 10 ml de BugBuster por litro y se centrifugaron a 39 000 g y 4 °C durante 20 min. El sedimento que contenía cuerpos de inclusión se resuspendió en tampón de extracción (clorhidrato de guanidina 6 M, fosfato de potasio 50 mM y glutatión reducido 1 mM) y se incubó en un agitador durante 15 min a temperatura ambiente. La suspensión se centrifugó a 39.000 g y 4 °C durante 30 min para eliminar la fracción insoluble. La fracción soluble filtrada se cargó en una columna de níquel y se lavó con 15 volúmenes de columna de tampón de lavado IMAC. ApoA1-IL4 se desdobló y volvió a plegar en la columna de níquel utilizando un tampón de desdoblamiento de gradiente lineal de 60 ml (urea 7 M, glutatión reducido 1 mM, glutatión oxidado 0,1 mM, fosfato de potasio 50 mM y NaCl 100 mM pH 6,8) hasta tampón de replegamiento 60 ml (glutatión reducido 1 mM, glutatión oxidado 0,1 mM, fosfato de potasio 50 mM y NaCl 100 mM pH 6,8) a 2,5 ml min−1. La apoA1-IL4 replegada se eluyó de la columna con imidazol 0,5 M, Tris 20 mM y NaCl 0,5 M a pH 7,9. El eluato se recogió, se concentró y se purificó adicionalmente y se intercambió el tampón mediante cromatografía de exclusión por tamaño (HiLoad 16/600 Superdex 75 Increment; GE Healthcare) equilibrada con tampón de almacenamiento PBS. Las fracciones se analizaron mediante SDS-PAGE, se agruparon, concentraron y congelaron rápidamente en nitrógeno líquido antes de almacenarlas a -80 °C. La masa de ApoA1-IL4 se confirmó mediante Q-ToF LC-MS (WatersMassLynx v4.1), utilizando MagTran V1.03 para MS.

Las células HEK293T se cotransfectaron con fuGENE (Promega), incluido el vector de transferencia pHR-apoA1–IL4m, empaquetando pCMVR8.74 y envolviendo pMD2.G en Opti-MEM (GIBCO) a 37 °C durante 24 h. Las células se lavaron con DMEM suplementado con FBS inactivado por calor al 2% y se incubaron durante 48 h. Para obtener el lentivirus que contenía pHR-apoA1–IL4m, el sobrenadante se centrifugó a 875 g para eliminar los restos celulares, se filtró a través de un filtro de jeringa PES de 0,45 µm y se centrifugó a 50 000 g durante 2 h a 4 °C. El sedimento que contenía el lentivirus pHR-apoA1–IL4m se resuspendió en medio de cultivo, se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido y se clasificó a -80 °C. Las células HEK293F se transdujeron con pHR-apoA1-IL4m que contenía lentivirus en medio de transfección (DMEM, 10% HI FBS, 1x polybrene (Sigma-Aldrich) durante 24 h. Posteriormente, las células se cultivaron en medio de expresión (50% EX-CELL 293 Medio sin suero para células HEK293 (Merck) y medio de expresión FreeStyle 293 al 50 % (Thermo Fisher Scientific), complementado con Glutamax, Pen-Strep al 1 % y 1 µg ml−1 de doxiciclina (Merck) en un agitador a 150 rpm durante 3 días a 37 ° C. El sobrenadante del cultivo que contenía apoA1–IL4m se centrifugó a 3500 g, 4 ° C durante 15 min y se filtró a través de un filtro de jeringa PES de 0,22 µm para eliminar los restos celulares. La fracción soluble filtrada se cargó en una columna StrepTactin XT 4flow de 5 ml (Cytiva) y se lavó con 5 volúmenes de columna de tampón W (NaCl 150 mM, Tris 100 mM, EDTA 1 mM pH 8) con un caudal de 1-2 ml min-1. Se eluyó ApoA1-IL4m de la columna con tampón W suplementado con biotina 50 mM. El eluato se recogió, se concentró y se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido antes de almacenarlo a -80 ° C. La masa de ApoA1-IL4m se confirmó mediante Q-ToF LC-MS (WatersMassLynx v4.1), utilizando MagTran V1. 03 para EM.

Para confirmar la fusión de apoA1 e IL4, se cargaron 100 ng de IL4 (BioLegend), apoA1 y apoA1–IL4 en un gel de poliacrilamida al 4–20 % (Bio-Rad). Después de la electroforesis en gel, las muestras se transfirieron a membranas de nitrocelulosa con tampón de transferencia (tampón TG 10x, metanol al 20 %). Posteriormente, las membranas se incubaron con tampón de bloqueo (leche al 5 %, tween al 0,1 % en PBS (PBST)) durante la noche a 4 °C. Los blots se incubaron con anticuerpos monoclonales primarios monoclonal anti-IL4 (HIL41, 1:200; sc-12723, Santa Cruz Biotechnology) y anti-apoA1 (B10, 1:100; sc-376818, Santa Cruz Biotechnology) durante 1 h a 4 °C. Después de la incubación con anticuerpos primarios, las membranas se lavaron y se incubaron con conjugado de IgG anti-ratón de conejo (H+L)-HRP (1:5000, 31457, Pierce). Los anticuerpos secundarios conjugados con HRP se detectaron con TMB (Thermo Fisher Scientific) y se visualizaron con el generador de imágenes de gel Image Quant (GE Healthcare).

Las mediciones de SPR se realizaron con un sistema Biacore ×100 SPR (GE Healthcare). La quimera alfa-FC del receptor IL4 humano (Biolegend) se inmovilizó en un chip sensor de proteína G (GE Healthcare). La serie de concentración de dilución Log2 constaba de apoA1-IL4 en un rango de 200 nM a 6,25 nM y de IL4 humana en un rango de 20 nM a 0,65 nM. Todas las muestras se prepararon en tampón HPS-EP (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, P20 al 0,005 % (v/v) pH 7,4). La asociación se monitorizó durante 180 s y la disociación durante 180 s con un caudal de 30 μl min−1. El chip sensor se regeneró con glicina 1,5 (glicina-HCl 10 mM, pH 1,5, GE Healthcare). La cinética se determinó ajustando los datos SPR de interacción para la unión 1:1.

Las células HEK-Blue IL4/IL13 se adquirieron de InvivoGen. Esta línea celular tiene una vía STAT6 completamente activa y porta un gen informador SEAP inducible por STAT6. Las células HEK-Blue IL4/IL13 producen SEAP en respuesta a IL4 e IL13. Los niveles de SEAP secretado se pueden determinar con QUANTI-Blue (InvivoGen). Se agregaron aproximadamente 180 μl de DMEM con 10 % de FBS y 1 % de Pen-Strep que contenía 5 × 104 células por pocillo en una placa de 96 pocillos. Posteriormente, se añadieron 20 μl de estímulo o vehículo y las células se incubaron durante 20-24 h a 37 °C. Posteriormente, se agregaron 180 μl de QUANTI-Blue por pozo a una placa de 96 pozos separada (fondo plano) y se agregaron 20 μl del sobrenadante celular. La placa se incubó durante 1 a 3 h a 37 °C y se midió la absorbancia a 640 nm en un lector de placas Tecan Spark para determinar los niveles de SEAP.

Todos los fosfolípidos se adquirieron de Avanti Polar Lipids. Se formularon cuatro aNP diferentes. Para aNP discoidales de soluciones madre (10 mg ml−1) en cloroformo, DMPC (133,5 μl) y colesterol (Sigma-Aldrich) (7,5 μl), y para aNP esféricas, POPC (66,5 μl), PHPC (17,5 μl), El colesterol (4,5 μl) y la tricaprilina (Sigma-Aldrich) (2,79 μl de 0,956 g ml-1 de reserva) se combinaron en un vial de vidrio y se secaron al vacío. La película resultante se volvió a disolver en una mezcla de acetonitrilo y metanol (95:5 %, 800 μl de volumen total). Para la formulación a base de apoA1 se utilizó colesterol (15 µl). Por separado, una solución de proteína apoA1 en PBS (6 ml, 0,1 mg ml−1), proteína apoA1–IL4 en PBS (6 ml, 0,17 mg ml−1) o apoA1–IL4m en PBS (6 ml, 0,18 mg ml−1) 1) fue preparado.

Ambas soluciones se inyectaron simultáneamente utilizando una bomba de microfluidos fusion 100 (Chemyx) en un mezclador en espiga Zeonor (Microfluidic Chipshop, código de producto 10000076) con un caudal de 0,75 ml min−1 para la solución de lípidos y un caudal de 6 ml min−1 para la solución de apoA1. La solución obtenida se concentró por filtración centrífuga utilizando un tubo Vivaspin de 10 kDa MWCO para discoide y un 100 kDa MWCO para aNPs esféricos a 3.500 g para obtener un volumen de 1 ml. Se añadió PBS (5 ml) y la solución se concentró a 5 ml; esto se repitió dos veces. La solución lavada se concentró a aproximadamente 1,5 ml y se filtró a través de un filtro de jeringa de PES de 0,22 μm para obtener las aNP terminadas. La concentración de proteínas en las muestras de aNP se cuantificó con el kit de ensayo de proteínas Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific). Para formular aNP fluorescentes, se disolvieron 0,5 mg de colorante DiOC18(3) (DiO) (Thermo Fisher Scientific) en la solución de cloroformo utilizada para preparar la película lipídica.

Las formulaciones de aNP obtenidas en PBS se filtraron a través de un filtro de jeringa de PES de 0,22 µm y se analizaron mediante DLS en un analizador Malvern Zetasizer Nano ZS. Los valores se informan como la distribución de tamaño promedio en número medio.

IL4, apoA1–IL4 e IL4-aNP se incubaron con dos excesos molares de DFO-p-NCS (5 mg ml-1 en DMSO) durante 2 h, se lavaron tres veces con tubos MWCO Vivaspin de 10 kDa para eliminar cualquier DFO-p que no haya reaccionado. -NCS. Para el marcaje radiactivo, las proteínas acopladas con DFO y las aNP se incubaron con 89Zr a 37 °C usando un termomezclador a 600 rpm durante 1 hy se lavaron tres veces usando tubos MWCO Vivaspin de 10 kDa para eliminar cualquier 89Zr sin reaccionar.

En primer lugar, la superficie de rejillas de cobre con soporte de carbono de encaje de malla 200 (Electron Microscopy Sciences) se trató con plasma durante 40 s utilizando un recubridor de carbono Cressington 208. Posteriormente, se aplicaron 3 ml de muestra de IL4-aNPs (~1 mg de proteína por ml) en una rejilla y se vitrificaron en una película delgada mediante vitrificación por inmersión en etano líquido utilizando un robot automatizado (FEI Vitrobot Mark IV). Las imágenes Cryo-TEM se realizaron en el cryoTITAN (Thermo Fisher Scientific), equipado con una pistola de emisión de campo, un filtro de imágenes Gatan posterior a la columna (modelo 2002) y una cámara CCD Gatan de 2k × 2k posterior al GIF (modelo 794). las imágenes se adquirieron a un voltaje de aceleración de 300 kV en modo TEM de campo claro con filtrado de energía de pérdida cero a 6500x (tasa de dosis de 1,64 electrones A-2 s-1) o 24 000x aumentos (tasa de dosis de 11,8 electrones A-2 s−1) y 1 s de tiempo de adquisición.

Se aislaron monocitos humanos de la sangre periférica de un donante sano como se ha descrito anteriormente. Se sembraron alrededor de 100.000 monocitos por pozo en un cubreobjetos con cámara tratado con cultivo celular (µ-Slide 8-well, IBID). Después de 2 h de incubación a 37 °C (fijación celular), las células se incubaron durante 2 h a 37 °C con una variante marcada con Cy5 de apoA1 desnudo o apoA1–IL4, aNP discoidales o IL4-aNP y aNP esféricos o IL4-aNP. Posteriormente, las células se lavaron con PBS y se fijaron con PFA al 4% durante 20 min. El receptor de IL4 se tiñó con un anticuerpo primario policlonal de conejo IgG1 anti-IL4R humano (Thermo Fisher Scientific; dilución 1:100) durante 24 h a 4 °C, seguido de un anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor 488 de cabra anti-conejo (Thermo Fischer Scientific; dilución 1:500) durante 1 h a temperatura ambiente. Las células teñidas se almacenaron en PBS a 4 °C. Para el dSTORM, las células se sumergieron en tampón de imágenes GLOXY (40 μg ml-1 de catalasa, 0,5 mg ml-1 de glucosa oxidasa, glucosa al 5 % y cisteamina 0,01 M en PBS, pH 8,0) durante unos minutos antes y durante la obtención de imágenes. . La adquisición se realizó en modo de fluorescencia de reflexión interna total, utilizando ONI Nanoimager (ONI). Está equipado con un objetivo de inmersión en aceite de 100×/1,4NA y una cámara sCMOS, y en este estudio se utilizaron láseres de 488 nm (200 mW) y 640 nm (1000 mW). Se adquirieron unos 10.000 fotogramas con un tiempo de exposición de 10 ms con un campo de visión de 50 × 80 µm. Los datos sin procesar se procesaron con el software ThunderSTORM (v1.3)46,47, lo que arrojó imágenes con una resolución espacial de 10 nm.

Se compraron ratones hembra C57BL/6 J (de aproximadamente 8 a 11 semanas de edad y aproximadamente 20 g) de Charles River, Alemania. Para los estudios de primates no humanos, se utilizaron dos monos cynomolgus (Macaca fascicularis) machos, de 15 y 16 años de edad. Todos los animales fueron co-alojados en condiciones climáticas controladas, respectivamente, a 20-24 °C, 45-65% de humedad con ciclos de luz-oscuridad de 12 h y se les proporcionó agua ad libitum. Los ratones fueron alimentados con una dieta de comida estándar y los primates no humanos fueron alimentados con la dieta Teklad Global 20% Protein Primate. El cuidado de los animales y los procedimientos experimentales se basaron en protocolos institucionales aprobados por la Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai. Todos los ratones fueron asignados aleatoriamente a grupos experimentales.

A los ratones C57BL/6 se les inyectaron por vía intravenosa variantes de IL4 marcadas con 89Zr, respectivamente, IL4 (53,6 ± 6,6 μCi), apoA1–IL4 (30,1 ± 0,9 μCi), IL4-aNP discoidales (146,1 ± 46,5 µCi) e IL4-aNP esféricos ( 108,6 ± 16,9 μCi). A dos primates no humanos se les inyectó IL4-aNP discoidales marcados con 89Zr (1079 μCi y 682 μCi). En puntos de tiempo predeterminados, 1, 2, 5, 10 y 30 min y 1, 2, 4, 8 y 24 h para ratones y 5, 30 y 90 min y 48 h para primates no humanos, después de la inyección se extrajo sangre y Se pesó y se midió la radiactividad usando un contador gamma automático Wizard2 2480 (Perkin Elmer). Los datos se corrigieron para el decaimiento radiactivo y se calculó el porcentaje de dosis inyectada por gramo de sangre (%ID por g). Los datos se ajustaron utilizando una regresión de descomposición de dos fases no lineal en GraphPad Prism, y la vida media ponderada en sangre se calculó mediante la ecuación (% rápido × t1/2 rápido + % lento × t1/2)/100. La biodistribución en ratones se determinó 24 h después de la inyección. Después de la perfusión de PBS, se recogieron y pesaron los tejidos de interés, y se midió la radiactividad utilizando un contador gamma automático Wizard2 2480 (Perkin Elmer). Los datos se corrigieron para el decaimiento radiactivo y se calculó el porcentaje de dosis inyectada por gramo de tejido (%ID por g).

A los ratones C57BL/6 se les inyectaron por vía intravenosa variantes de IL4 marcadas con 89Zr, respectivamente, IL4 (53,6 ± 6,6 μCi), apoA1–IL4 (30,1 ± 0,9 μCi), IL4-aNP discoidales (146,1 ± 46,5 μCi) e IL4-aNP esféricos ( 108,6 ± 16,9 μCi). Después de 24 h, los ratones se anestesiaron con isoflurano al 1,0 % en O2 a un caudal de ∼1,0 l min−1. Las exploraciones PET-CT se adquirieron utilizando un Mediso nanoScan PET-CT (Mediso). Se realizó una TC de cuerpo entero (energía, 50 kVp; corriente, 180 μAs; tamaño de vóxel isotrópico, 0,25 mm) seguida de una exploración PET de 20 min. La reconstrucción se realizó con corrección de atenuación utilizando el algoritmo de reconstrucción TeraTomo 3D del software Mediso Nucline v3.04.020.0000. Las coincidencias fueron excluidas por una ventana de energía entre 400 keV y 600 keV. El tamaño de vóxel fue isotrópico con 0,4 mm de ancho y la reconstrucción se aplicó durante cuatro iteraciones completas, seis subconjuntos por iteración.

Los tejidos se colocaron en un casete de película contra una placa de formación de imágenes con fósforo (BASMS-2325, Fujifilm) a -20 °C para determinar la distribución de radiactividad. Las placas se leyeron a una resolución de píxeles de 25 mm con un lector de placas Typhoon 7000IP (GE Healthcare).

Para la especificidad celular, a los ratones se les inyectó por vía intravenosa IL4-aNP marcados con DiO que se dejaron circular durante 24 h. Posteriormente, se sacrificaron los ratones y se crearon suspensiones de células individuales a partir de sangre, bazo y médula ósea como se describió anteriormente. Las suspensiones celulares se incubaron con anti-CD115, anti-CD11b, anti-Ly6C, anti-Ly6G, anti-CD19, anti-CD45, anti-CD11c, anti-CD3 y anti-F4/80. Se utilizó agua viva o muerta como tinción de viabilidad. Posteriormente, las células se lavaron y se resuspendieron en tampón FACS. Todos los datos se adquirieron en un citómetro de flujo Aurora 5 l (Cytek Biosciences). Se detectaron DiO-IL4-aNP en el canal FITC.

Después del ayuno nocturno, los primates no humanos se anestesiaron con ketamina (5 mg kg-1) y dexmedetomidina (0,0075-0,015 mg kg-1). Se inyectaron primates no humanos con 1,114 mCi y 0,682 mCi discoidales de IL4-aNP marcados con 89Zr, a una dosis de aproximadamente 0,1 mg kg−1. Se realizaron imágenes de PET dinámicas durante 60 minutos después de la infusión, y se realizaron exploraciones PET-MRI estáticas adicionales 1 hora y 48 horas después de la inyección. Además, se extrajo sangre durante la toma de imágenes a los 5 min, 30 min y 120 min después de la inyección. Las imágenes PET y MRI se adquirieron utilizando un sistema 3T PET-MRI (Biograph mMR, Siemens Healthineers). Comenzando simultáneamente con la inyección de aNP, se realizó una imagen PET dinámica utilizando una posición de cama que cubría el tórax y el abdomen. Los parámetros de la RM fueron los siguientes: plano de adquisición, coronal; tiempo de repetición, 1.000 ms; tiempo de eco, 79 ms; número de rebanadas, 144; número de promedios, 4; resolución espacial, 0,5 × 0,5 × 1,0 mm3; y duración de la adquisición, 42 min y 42 s. Después de la adquisición de imágenes PET dinámicas, se adquirieron imágenes PET estáticas de cuerpo entero desde el cráneo hasta la pelvis, utilizando 4 posiciones de cama consecutivas de 15 min cada una. Simultáneamente con cada cama, las imágenes de RM se adquirieron como se describe anteriormente, excepto que se usaron solo 1,4 promedios de señal, número de cortes 160 y resolución espacial 0,6 × 0,6 × 1,0 mm3 (duración de la adquisición, 14 min 56 s por cama). También se realizaron imágenes de PET y RM de cuerpo entero a las 48 h después de la inyección, utilizando 4 posiciones de lecho de PET de 30 min cada una, con los siguientes parámetros de RM: plano de adquisición, coronal; tiempo de repetición, 1.000 ms; tiempo de eco, 79 ms; número de rebanadas, 224; número de promedios, 2; resolución espacial, 0,6 × 0,6 × 1,0 mm3; y duración de la adquisición, 29 min y 56 s. Las imágenes de RM de cuerpo entero de cada cama fueron cotejadas automáticamente por el escáner. Después de la adquisición, los datos brutos de PET de cada lecho se reconstruyeron y recopilaron fuera de línea utilizando las herramientas e7tools patentadas de Siemens con un algoritmo de maximización de expectativas de subconjuntos ordenados con corrección de función de dispersión de puntos para 3 iteraciones y 24 subconjuntos. Además, se aplicó filtro Gaussiano de 4 mm a las imágenes. Se usó un mapa de atenuación de tres compartimentos (tejido blando, pulmón y aire) para la atenuación.

El análisis de imágenes se realizó utilizando Osirix MD, versión 11.0. Las imágenes de RM de cuerpo entero se fusionaron con imágenes PET y se analizaron en un plano coronal. Las regiones de interés (ROI) se dibujaron en tejidos de interés, incluidos el bazo, el hígado, los riñones, los pulmones, el corazón, el cerebelo y el cerebro, que se rastrearon en su totalidad, y se determinó la absorción de la médula ósea utilizando tres vértebras en la columna lumbar. Para cada ROI, se calcularon los valores medios de captación estandarizados (SUV). La captación discoidal de IL4-aNP marcada con 89Zr por órgano se expresó como la media de todos los valores medios de SUV por órgano.

Para el modelo de tolerancia in vivo, se toleraron por vía intraperitoneal ratones C57BL/6 hembra de 11 semanas de edad con 0,1 mg kg−1 de LPS de peso corporal. A las 24 hy 48 h, los ratones se trataron por vía intravenosa con 200 µg de IL4m-aNP o PBS. Posteriormente, los ratones se volvieron a desafiar con una inyección intraperitoneal de 0,1 mg kg-1 de LPS a las 72 h. Después de 90 min, se sacrificaron los ratones, se recolectó sangre para ELISA y se crearon suspensiones de células individuales a partir de sangre, bazo y médula ósea como se describió anteriormente. Para el protocolo de tinción, las muestras de sangre para ELISA se dejaron coagular a TA durante 30 min. El suero se tomó después de centrifugar a 1000 g durante 10 min a 4 °C. Se realizaron ELISA de ratón TNF e IL6 (Biolegend) de acuerdo con los protocolos del fabricante. El cuidado de los animales y los procedimientos experimentales se basaron en protocolos institucionales aprobados por el Comité de Experimentos con Animales de Nijmegen.

Los datos se muestran como media ± sd, a menos que se indique lo contrario. Los puntos de datos individuales en los gráficos son réplicas biológicas, no repeticiones técnicas. El número de puntos de datos se puede distinguir claramente en cada figura o n se indica en la leyenda de la figura. A menos que se indique lo contrario, los análisis estadísticos se realizaron en Graphpad Prism (v9, Graphpad Software). Para la inmunidad entrenada y los experimentos de estimulación aguda con monocitos humanos primarios (pareados, no paramétricos), se utilizaron pruebas de rango con signo de Wilcoxon. Los métodos estadísticos para el análisis de secuenciación de ARN se describen anteriormente. Los valores de P bilaterales inferiores a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los principales datos que respaldan los resultados de este estudio están disponibles en el documento y su información complementaria. Los conjuntos de datos sin procesar y analizados generados durante el estudio están disponibles para fines de investigación de los autores correspondientes a pedido razonable. Los datos de secuenciación de ARN sin procesar están disponibles en NCBI Gene Expression Omnibus con el número de acceso GSE185433.

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Agradecemos a M. Jaeger (Radboudumc) por proporcionar amablemente Candida albicans marcada con isotiocianato de fluoresceína. D. Williams (East Tennessee State University) proporcionó el β-glucano que usamos en nuestros experimentos iniciales. H. Lemmers (Radboudumc) preparó amablemente el lipopolisacárido purificado utilizado para la estimulación de monocitos y macrófagos humanos primarios. Parte de las figuras se prepararon usando (entre otro software) Biorender.com. BN cuenta con el apoyo de una subvención para investigadores del Consejo Nacional de Investigación Médica y de Salud (Australia) (APP1173314). Este trabajo fue apoyado por las subvenciones R01 HL144072, R01 CA220234 y P01 HL131478 de los Institutos Nacionales de Salud, así como una subvención Vici del Consejo de Investigación Holandés NWO y una subvención avanzada ERC (todas para WJMM). MGN recibió el apoyo de una subvención Spinoza del Consejo de Investigación holandés NWO y una subvención avanzada ERC (# 833247).

Estos autores contribuyeron igualmente: David P. Schrijver, Rutger J. Röring.

Departamento de Ingeniería Biomédica, Universidad Tecnológica de Eindhoven, Eindhoven, Países Bajos

David P. Schrijver, Jeroen Deckers, Anne de Dreu, Eveline G. Nugraha, Roderick S. Oosterwijk, Ewelina Kluza, Roy van der Meel, Maarten Merkx y Willem JM Mulder

Departamento de Medicina Interna y Centro Radboud de Enfermedades Infecciosas (RCI), Centro Médico de la Universidad Radboud, Nijmegen, Países Bajos

David P. Schrijver, Rutger J. Röring, Jeroen Deckers, Yohana C. Toner, Bram Priem, Yuri van Elsas, Tom Anbergen, Simone JCFM Moorlag, Thijs J. Beldman, Leo AB Joosten, Mihai G. Netea y Willem JM Mulder

Instituto Radboud de Ciencias Moleculares de la Vida, Centro Médico de la Universidad de Radboud, Nijmegen, Países Bajos

Rutger J. Röring, Jeroen Deckers, Tom Anbergen, Anouk MD Becker, Simone JCFM Moorlag, Aron Jansen, Peter Pickkers, Matthijs Kox, Leo AB Joosten y Mihai G. Netea

Instituto de Imágenes e Ingeniería Biomédica, Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai, Nueva York, NY, EE. UU.

Yohana C. Toner, Geoffrey Prevot, Bram Priem, Jazz Munitz, Yuri van Elsas, Anthony Azzun, Carlos Pérez-Medina, Mandy MT van Leent, Abraham JP Teunissen & Zahi A. Fayad

Departamento de Bioquímica Médica, Centros Médicos de la Universidad de Ámsterdam, Ámsterdam, Países Bajos

Bram primer

Laboratorio de Angiogénesis, Amsterdam UMC, Cancer Center Amsterdam, Amsterdam, Países Bajos

Bram primer

Departamento de Cirugía, Centro Médico de la Universidad de Radboud, Nijmegen, Países Bajos

Laszlo A. Groh

Instituto Radboud de Ciencias de la Salud, Centro Médico de la Universidad de Radboud, Nijmegen, Países Bajos

Laszlo A. Groh

Departamento de Inmunología Tumoral, RIMLS, Centro Médico de la Universidad de Radboud, Nijmegen, Países Bajos

Anouk MD Becker

Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC), Madrid, Spain

Carlos Pérez-Medina

Grupo de Epigenética, Instituto de Investigación Infantil Murdoch, Hospital Infantil Real y Departamento de Pediatría, Universidad de Melbourne, Parkville, Victoria, Australia

boris novakovic

Departamento de Medicina de Cuidados Intensivos y Centro Radboud de Enfermedades Infecciosas (RCI), Centro Médico de la Universidad de Radboud, Nimega, Países Bajos

Aron Jansen, Peter Pickkers y Matthijs Kox

Instituto de Investigación Cardiovascular, Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai, Nueva York, NY, EE. UU.

Mandy MT van Leent y Abraham JP Teunissen

Departamento de Genética Médica, Universidad de Medicina y Farmacia Iuliu Hatieganu, Cluj-Napoca, Rumania

Leo AB Joosten

División de Cardiología, Departamento de Medicina, Programa Marc and Ruti Bell en Biología Vascular, Facultad de Medicina de la Universidad de Nueva York, Nueva York, NY, EE. UU.

eduardo pescador

Departamento de Genómica e Inmunorregulación, Instituto de Ciencias Médicas y de la Vida (LIMES), Universidad de Bonn, Bonn, Alemania

Mihai G. Netea

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WJMM y MGN conceptualizó el estudio. WJMM, MGN, ZAF, EAF y RvdM supervisaron el estudio. RJR, SJCFMM y LABJ desentrañaron el modo de acción de IL4. DPS, JD, AdD y MM diseñaron, expresaron y optimizaron proteínas de fusión. DPS, JD, AdD, RSO, EGN, GP, AA, CP-M., EK y AJPT produjeron, etiquetaron y caracterizaron nanopartículas. DPS, RJR, LAG, AMDB, BN, MK, AJ, PP y TJB realizaron experimentos ex vivo (humanos), in vivo e in vitro. DPS, RJR, YCT, JD, BP, JM, YvE, TA y MMTvL realizaron experimentos in vivo y ex vivo con primates no humanos en ratones. DPS, RJR, MGN y WJMM escribieron el manuscrito y produjeron las figuras. Todos los autores revisaron el manuscrito y proporcionaron comentarios.

Correspondencia a Mihai G. Netea o Willem JM Mulder.

WJMM, LABJ y MGN son cofundadores científicos y tienen participación accionaria en Trained Therapeutix Discovery. WJMM es CSO de Trained Therapeutix Discovery. WJMM y MGN son cofundadores científicos y tienen participación accionaria en BioTrip.

Nature Biomedical Engineering agradece a Jeffrey Hubbell, Srinivasa Reddy y Markus Weigand por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

( a ) Niveles de lactato sobrenadante después de 24 horas de estimulación con IL4. (b) Niveles de lactato sobrenadante acumulados el día 6 después del entrenamiento con IL4. ( c ) Medición de citometría de flujo de la fagocitosis de Candida albicans marcada con FITC el día 6 después del entrenamiento con IL4. ( d ) Medición de citometría de flujo de marcadores de superficie comúnmente asociados con la activación de IL4 de monocitos / macrófagos, el día 6 después del entrenamiento con IL4. ( e ) Medición de citometría de flujo del marcador de células dendríticas CD1c en macrófagos entrenados en IL4 y células dendríticas derivadas de monocitos (moDC). Los datos se presentan como media (citometría de flujo: intensidad de fluorescencia media geométrica) ± DE.

(a) Producción de TNF/IL6 después de la reestimulación de células que fueron entrenadas con IL4 mientras bloqueaba rutas de señalización clave de IL4 (b) Aumento de veces de TNF/IL6 después de la reestimulación de células que fueron entrenadas con IL4 mientras bloqueaba rutas de señalización clave de IL4 . ( c ) Mapa de calor del transcriptoma de los monocitos directamente después del aislamiento y después de la estimulación con RPMI, IL4, LPS o LPS + IL4. ( d ) Análisis de enriquecimiento del motivo del factor de transcripción de los efectos agudos de IL4 en monocitos estimulados con LPS. ( e ) Análisis de enriquecimiento de vías del efecto de IL4 en la estimulación aguda de LPS. ( f ) Análisis ChIP-qPCR de TNF en células entrenadas con IL4. Los datos se presentan como media ± SD.

Cinética de la unión de IL4 a IL4Rα usando SPR.

( a ) Evaluación DLS del tamaño de partícula de aNP convencionales. ( b ) Estabilidad DLS de aNP convencionales a lo largo del tiempo.

( a ) Autorradiografía de órganos 24 h después de la inyección de 89Zr-IL4-aNPs en ratones. ( b ) Recuento gamma en órganos vitales 24 h después de la inyección de 89Zr-IL4-aNPs en ratones (n = 5). ( c ) Proporciones de absorción por órganos diana sobre órganos de eliminación en ratones ANOVA de 2 vías con análisis post-hoc de Turquía. ( d ) Exploraciones dinámicas de PET / MRI de primates no humanos a los 1, 30 y 60 minutos después de la inyección de 89Zr-IL4-aNPs. ( e ) SUV medio específico de órgano en primates no humanos durante 1 hora después de la administración de 89Zr-IL4-aNP. ( f ) Estrategia de activación para la médula ósea (arriba) y el bazo (abajo) en experimentos para medir la especificidad del tipo de célula de IL4-aNP discoidales marcados con DiO. Los datos se presentan como media ± DE cuando corresponda.

( a ) Fosforilación de STAT6, medida por citometría de flujo después de 30 minutos de estimulación con RPMI, IL4 o diferentes concentraciones de IL4-aNP. Los datos se expresan en relación con la señal provocada por la IL4 desnuda. ( d ) Ensayo de polarización de células T por citometría de flujo, después de 7 días de reacción de leucocitos mixtos con macrófagos entrenados con IL4 (-aNP) o control. (b) Producción de TNF después de la estimulación con LPS de monocitos aislados antes y 4 horas después de la exposición a endotoxina in vivo en humanos. ( c ) Niveles de TNF e IL6 después de la reestimulación ex vivo de células toleradas por LPS in vivo humanas (izquierda) y los mismos datos expresados ​​​​como cambios de pliegue en relación con las muestras de endotoxemia tolerantes (derecha).

Tablas complementarias 1 a 5 y geles SDS-PAGE sin procesar y transferencias Western para la figura 3.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Schrijver, DP, Röring, RJ, Deckers, J. et al. Resolución de la inmunoparálisis inducida por sepsis a través de la inmunidad entrenada al dirigir la interleucina-4 a las células mieloides. Nat. biomedicina ing (2023). https://doi.org/10.1038/s41551-023-01050-0

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Recibido: 21 diciembre 2021

Aceptado: 02 mayo 2023

Publicado: 08 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41551-023-01050-0

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