Caracterización de dos bacteriófagos líticos que infectan el complejo Streptococcus bovis/equinus (SBSEC) de rumiantes coreanos

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 9110 (2023) Citar este artículo

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El complejo Streptococcus bovis/equinus (SBSEC) es una de las bacterias del rumen productoras de ácido láctico más importantes que causan acidosis ruminal subaguda. A pesar de la importancia de las bacterias ruminales, rara vez se han caracterizado los bacteriófagos líticos (fagos) capaces de infectar SBSEC en el rumen. Por lo tanto, describimos las características biológicas y genómicas de dos fagos líticos (designados como vB_SbRt-pBovineB21 y vB_SbRt-pBovineS21) que infectan varias especies de SBSEC, incluida la S. ruminicola recientemente informada. Los fagos SBSEC aislados eran morfológicamente similares a Podoviridae y podían infectar a otros géneros de bacterias productoras de ácido láctico, incluidos Lactococcus y Lactobacillus. Además, mostraron una alta estabilidad térmica y de pH, y esas características inducen una fuerte adaptación al ambiente ruminal, como el bajo pH que se encuentra en la acidosis ruminal subaguda. La filogenia basada en el genoma reveló que ambos fagos estaban relacionados con el fago C1 de Streptococcus en el Fischettivirus. Sin embargo, tenían una similitud de nucleótidos más baja y arreglos genómicos distintos que el fago C1. La actividad bacteriolítica del fago se evaluó usando S. ruminicola, y los fagos inhibieron eficientemente el crecimiento bacteriano planctónico. Además, ambos fagos podrían prevenir biopelículas bacterianas de varias cepas de SBSEC y otras bacterias productoras de ácido láctico in vitro. Por lo tanto, los dos fagos SBSEC recién aislados se clasificaron como nuevos miembros de Fischettivirus y podrían considerarse como posibles agentes de control biológico contra las bacterias SBSEC ruminales y sus biopelículas.

El complejo Streptococcus bovis/Streptococcus equinus (SBSEC) es un grupo de bacterias comensales en el tracto gastrointestinal de humanos y animales domésticos, incluidas vacas, cabras y caballos1. El grupo SBSEC ha sido clasificado en base a las características fenotípicas de las especies, incluyendo Streptococcus (S.) equinus (sinónimo de S. bovis), S. gallolyticus subsp. galloyticus, S. gallolyticus subesp. pasteurianus, S. gallolyticus subsp. macedonicus, S. infantarius subsp. infantarius, S. lutetiensis y S. alactolyticus2. Recientemente, una nueva especie, S. ruminicola, aislada de rumiantes en Corea del Sur, fue propuesta como un nuevo miembro con distintas propiedades biológicas entre las cepas de este grupo3. Las (sub)especies específicas de SBSEC han causado infecciones clínicas, como endocarditis infecciosa y bacteriemia con cáncer colorrectal. También están involucrados en trastornos metabólicos animales, como la acidosis ruminal subaguda en rumiantes4,5,6, lo que indica la importancia de este grupo como patógenos potenciales.

Los bacteriófagos (fagos) infectan naturalmente a las bacterias a través de dos ciclos de vida de replicación (lítico y lisogénico) y tienen una alta especificidad en el huésped, evitando alteraciones en la comunidad de microbiomas7. Los atributos únicos de los fagos los convierten en antimicrobianos potenciales para el control selectivo de varias bacterias patógenas. La biopelícula bacteriana que consta de sustancias poliméricas extracelulares es altamente resistente a los antibióticos, el calor y las condiciones ácidas, lo que da como resultado un aumento de bacterias resistentes a los antimicrobianos en las comunidades bióticas y abióticas8. Se ha informado que los fagos controlan la formación de biopelículas y penetran en la biopelícula existente en las superficies de las células planctónicas9. Los fagos se han encontrado en el rumen en aproximadamente 108 poblaciones de partículas por gramo de contenido ruminal10, pero se sabe poco en términos de las propiedades biológicas de la mayoría de los fagos en entornos de cultivo estrictos. Hasta ahora, 14 fagos que infectan a Streptococcus spp. fueron aprobados taxonómicamente por el Comité Internacional de Taxonomía de Virus (ICTV; https://ictv.global/taxonomy), y aproximadamente 800 genomas completamente secuenciados, incluidos los fagos de Streptococcus, están disponibles en la base de datos GenBank. Sin embargo, los estudios sobre fagos que infectan a SBSEC son relativamente más escasos que los de otros Streptococcus sp. a pesar de la importancia de las bacterias ruminales. Solo un genoma del aislado del fago SBSEC ϕSb01, con morfotipos de la familia Siphoviridae, está actualmente disponible en el Portal del Genoma del Joint Genome Institute11.

Sin embargo, los fagos SBSEC son uno de los fagos bien estudiados entre los virus que infectan bacterias ruminales, como Ruminococcus albus de la familia Myoviridae12 y Bacteroides sp. de la familia Podoviridae13. Además, se han caracterizado morfológica y genéticamente varios aislados de fagos SBSEC líticos o lisogénicos14,15,16,17. Además, se ha informado de la posible aplicación de la endolisina basada en profagos de un genoma SBSEC secuenciado para controlar la microbiota del rumen18. Sin embargo, hasta donde sabemos, aún no se han informado fagos SBSEC con morfotipos de la familia Podoviridae. Por lo tanto, informamos sobre dos fagos líticos capaces de infectar varias bacterias SBSEC ruminales, incluida la recientemente informada S. ruminicola y otros géneros de bacterias productoras de ácido láctico (por ejemplo, Lactococcus y Lactobacillus) con un gran potencial para aplicaciones biotecnológicas. Se examinaron las características biológicas y genómicas de ambos fagos SBSEC (designados como vB_SbRt-pBovineB21 y vB_SbRt-pBovineS21) y su capacidad para controlar las biopelículas bacterianas. Este es, hasta donde sabemos, el primer informe de fagos con morfotipos de Podoviridae, que infectan especies de SBSEC y otras bacterias productoras de ácido láctico que se encuentran en el rumen de los rumiantes.

En este estudio se aislaron un total de dos fagos SBSEC, y estos se designaron como vB_SbRt-pBovineB21 y vB_SbRt-pBovineS21. El fago SBSEC vB_SbRt-pBovineB21 se aisló de muestras fecales recolectadas de una granja Hanwoo (Chungcheongnam-do, Corea) y vB_SbRt-pBovineS21 se aisló de muestras de aguas residuales obtenidas de una planta de tratamiento de aguas residuales (Daejeon, Corea). Usando el método de agar de doble capa, ambos fagos aislados pudieron producir placas claras en céspedes usando la cepa S. ruminicola KCTC 43306 de la Colección Coreana para Cultivos Tipo (KCTC) como huésped. El análisis de microscopía electrónica de transmisión (TEM) reveló que los fagos vB_SbRt-pBovineB21 y vB_SbRt-pBovineS21 tienen una cabeza icosaédrica de 49,2 y 46,2 nm de diámetro, respectivamente. También exhibieron colas cortas no contráctiles de 13,3 y 12,5 nm, respectivamente (Fig. 1). En consecuencia, ambos fagos se clasificaron morfológicamente como miembros de la familia Podoviridae. El análisis del rango de huéspedes de los fagos aislados reveló que, entre las cepas de S. equinus, la lisis fue menor para los aislamientos de Bos taurus (15,4 %) y Bos taurus coreanae (35,3 %). Sin embargo, la mayoría de los aislamientos de Capra aegagrus hircus, incluidos S. ruminicola (100 %), S. equinus (64,3–71,4 %) y S. lutetiensis (100 %), fueron lisados por estos fagos (Tabla 1). No se observó lisis en las nueve cepas tipo de SBSEC y S. agalactiae. En particular, ambos fagos podrían infectar todo tipo de cepas de los otros géneros, Lactobacillus spp. y Lactococcus lactis subsp. lactis, utilizada en este estudio.

Micrografías electrónicas de transmisión de los fagos SBSEC aislados. ( a ) La imagen TEM del fago vB_SbRt-pBovineB21 que muestra una cabeza icosaédrica (49,2 nm) y una cola corta no contráctil (13,3 nm) se indica mediante una flecha negra. (b) La imagen TEM del fago vB_SbRt-pBovineS21 que muestra una cabeza icosaédrica (46,2 nm) y una cola corta no contráctil (12,5 nm) se indica mediante una flecha negra. La barra de escala es de 50 nm.

Más del 80% de los fagos SBSEC libres se redujeron en aproximadamente 15 minutos, lo que indica que los fagos se adsorbieron de manera eficiente en la cepa huésped (Fig. 2a, b). El tiempo de latencia y el tamaño de la explosión se determinaron usando la curva de crecimiento de un paso de los fagos aislados contra S. ruminicola KCTC 43306 a la multiplicidad de infección (MOI) óptima de 0,0001. El tiempo de latencia y el tamaño de ráfaga del fago vB_SbRt-pBovineB21 fueron de aproximadamente 20 min y 367,5 PFU/células infectadas, respectivamente, como se muestra en la Fig. 2c. Además, el fago vB_SbRt-pBovineS21 tenía un tiempo de latencia y un tamaño de ráfaga de aproximadamente 20 min y 198,3 UFP/células infectadas, respectivamente (Fig. 2d).

Tasa de adsorción y curva de crecimiento de un paso de los fagos SBSEC aislados. Las tasas de adsorción de los fagos vB_SbRt-pBovineB21 (a) y vB_SbRt-pBovineS21 (b) disminuyeron a menos del 80 % a los 15 min. Las curvas de crecimiento de un paso de los fagos vB_SbRt-pBovineB21 (c) y vB_SbRt-pBovineS21 (d) muestran un tiempo de latencia de 20 min y un tamaño de explosión de 367,5 y 198,3 PFU/mL, respectivamente. En todos los experimentos, se realizó un ensayo por triplicado de forma independiente usando S. ruminicola KCTC 43,306. Las barras de error indican el error estándar de la media.

La estabilidad de los fagos SBSEC aislados se determinó a varias temperaturas y valores de pH. Con respecto a los resultados de estabilidad térmica, el fago vB_SbRt-pBovineB21 fue relativamente estable a 4, 16, 25, 37, 45 y 56 °C durante 3 h, pero se inactivó por completo después de la incubación a 80 °C durante 3 h. El fago vB_SbRt-pBovineS21 fue relativamente estable a 4, 16, 25, 37 y 45 °C, pero se inactivó por completo después de la incubación a 56 y 80 °C durante 3 h (Fig. 3a). Los resultados de estabilidad del pH revelaron que ambos fagos sobrevivieron a un rango de pH de 3 a 12 y se inactivaron por completo a pH 2, lo que sugiere que ningún fago podría sobrevivir en ambientes fuertemente ácidos y alcalinos (Fig. 3b).

Estabilidad de los fagos SBSEC aislados en diferentes condiciones térmicas y de pH. (a) La estabilidad térmica de ambos fagos aislados a 4, 16, 25, 37, 45, 56 y 80 °C. (b) La estabilidad del pH de los fagos aislados a pH 2, 3, 4, 4,6, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12. Todos los experimentos se realizaron de forma independiente por triplicado. Las líneas verticales indican el error estándar de la media. Las barras marcadas con las mismas letras no indican diferencia significativa (p < 0,05).

Los efectos bacteriolíticos de los fagos SBSEC aislados contra S. ruminicola KCTC 43306 se compararon en diferentes MOI. Como se presenta en la Fig. 4, los valores de densidad óptica (OD; 600 nm) de todos los MOI (0,001, 0,01, 0,1, 1 y 10) aumentaron rápidamente durante las primeras 2 h. Posteriormente, los valores de DO 600 nm de los grupos tratados con fagos fueron considerablemente más bajos que los del control positivo (MOI de 0). En ambos fagos, los valores de DO 600 nm de los grupos tratados con fagos se mantuvieron (MOI de 0,001, 0,01, 0,1 y 1) o disminuyeron constantemente (MOI de 10) hasta 10 h después de la inoculación del fago, lo que indica que el crecimiento de el fago inhibía eficazmente las células huésped.

Los efectos bacteriolíticos de los fagos SBSEC aislados en las diferentes MOI. Actividades de lisis celular de los fagos vB_SbRt-pBovineB21 (a) y vB_SbRt-pBovineS21 (b) a una MOI de 10, 1, 0,1, 0,01 y 0,001 contra S. ruminicola KCTC 43,306 y sin el fago utilizado como control. Cada experimento se realizó de forma independiente por triplicado. Las barras de error indican el error estándar de la media.

El genoma de los fagos vB_SbRt-pBovineB21 y vB_SbRt-pBovineS21 consta de un ADN lineal de doble cadena de 16 260 pb y 17 280 pb de longitud con un contenido de G + C de > 33 % y 27 y 26 marcos de lectura abiertos (ORF) predichos, respectivamente. . Los mapas del genoma se muestran en la Fig. 5a y la Fig. 5b. En ambos fagos, se predijeron 10 ORF como proteínas funcionales, incluida la proteína de encapsidación, la ADN polimerasa, las proteínas asociadas al sistema de lisis putativo, la proteína de la cola del fago, la proteína de la fibra de la cola, el adaptador de cabeza a cola, la proteína del cuello superior y la proteína principal de la cápside. Además, se detectaron 13 dominios conservados en ORF predichos funcionalmente basados en comparaciones de homología de proteínas originadas en fagos. Más de 10 ORF en los fagos vB_SbRt-pBovineB21 y vB_SbRt-pBovineS21 fueron similares (identidades de aminoácidos; 25,5–63,6 %) a las proteínas predichas del fago C119 de Streptococcus. Además, más de cuatro ORF eran similares (identidades de aminoácidos < 45 %) a otros fagos de Podoviridae disponibles en la base de datos GenBank, lo que indica que los fagos SBSEC aislados poseen estructuras genómicas únicas. Los ORF restantes se predijeron como proteínas hipotéticas, con proteínas desconocidas anotadas mediante búsquedas BLASTP. Además, los dominios transmembrana se predijeron en tres ORF y no se predijo ningún péptido señal en todos los ORF de ambos fagos (Tablas complementarias 1 y 2). Los genes de ARNt y los genes asociados con la virulencia bacteriana y la resistencia a los antimicrobianos no se detectaron en los genomas de ambos fagos aislados. Se predijo que el análisis de PhageTerm se permutaría con extremos redundantes en los fagos aislados. En particular, los genomas de los fagos vB_SbRt-pBovineB21 y vB_SbRt-pBovineS21 tenían grandes similitudes con 18 ORF predichos y 13 proteínas funcionales putativas divididas en cuatro grupos funcionales: dos metabolismos de nucleótidos, cuatro estructuras y empaques virales, cuatro lisis y tres estructuras de cola. Sin embargo, ambos fagos diferían claramente en los genes presentes en las regiones intergénicas entre ORF 13 y ORF 15. En el fago vB_SbRt-pBovineS21, ORF 14 (171 pb) y ORF 15 (232 pb) estaban ubicados junto a ORF 13, codificando una cola proteína de 583 pb seguidas; sin embargo, el ORF 14 presentado en el fago vB_SbRt-pBovineS21 no se detectó en el fago vB_SbRt-pBovineB21 (Fig. 6).

Mapas del genoma de los fagos SBSEC aislados. Los mapas circulares del genoma de los fagos vB_SbRt-pBovineB21 (a) y vB_SbRt-pBovineS21 (b) indican cada ORF predicho en color según las categorías funcionales: proteína hipotética (azul), sistema de lisis (rosa) y proteína adicional asociada al fago ( naranja). El carril interior, de color amarillo verdoso, representa la homología blástica para los genomas del fago C1 de Streptococcus (AY212251.1). El contenido de GC, la desviación positiva de GC y la desviación negativa de GC se indican en negro, verde y púrpura, respectivamente.

Comparaciones genómicas de los fagos SBSEC aislados y el fago C1 de Streptococcus. La visualización lineal está representada por regiones codificantes de genomas de fagos con flechas de colores. Los ORF anotados funcionalmente en relación con las proteínas asociadas al fago, como la estructura y el empaquetamiento, la replicación del ADN, la lisis del huésped y la proteína hipotética, se colorearon de azul, rosa, amarillo y negro. Además, la similitud de secuencia se indica mediante la intensidad de gris.

La comparación del genoma secuenciado de los fagos vB_SbRt-pBovineB21 y vB_SbRt-pBovineS21 con otros fagos actualmente disponibles en la base de datos GenBank sugirió que los fagos aislados eran más similares al fago C1 de Streptococcus (AY212251.1) con < 77% de identidad basada en < 2 % de cobertura de consulta (Tabla complementaria 3). Por lo tanto, según los estándares de clasificación propuestos por ICTV20, los fagos aislados se clasificaron en la familia Rountreeviridae (Tabla complementaria 4). Además, en función de la similitud con la secuencia de aminoácidos, se realizó un análisis genómico comparativo entre los fagos SBSEC aislados y el fago C1 utilizando Easyfig. El análisis reveló que los contenidos genómicos generales y las disposiciones de los fagos SBSEC eran similares a los del fago C1, el único miembro del género Fischettivirus en la familia Rountreeviridae. Sin embargo, los fagos SBSEC mostraron varias diferencias con el fago C1: (i) Aunque la mayoría de los genes con funciones similares se ubicaron secuencialmente en el genoma de tres fagos, los rangos de la identidad de aminoácidos de los ORF predichos en los fagos SBSEC contra fago C1 fueron menos del 63,6%. (ii) Aunque los fagos SBSEC poseían un sistema de lisis del huésped similar (holin-plyCB-lil-plyCA) al fago C119, los cuatro genes (lil (ORF 10 y ORF 9), plyCB (ORF 11 y ORF 10), holin (ORF 12 y ORF 11), y plyCA (ORF 13 y ORF 12)) se encontraron insertados inversamente en los genomas secuenciados y las ubicaciones internas de holin y lil se cambiaron alrededor de plyCB (Fig. 6) Por lo tanto, la evidencia genómica respalda firmemente que Los fagos vB_SbRt-pBovineB21 y vB_SbRt-pBovineS21 son claramente diferentes del fago C1 y, por lo tanto, se consideran especies nuevas. Para determinar la posición taxonómica de los fagos SBSEC vB_SbRt-pBovineB21 y vB_SbRt-pBovineS21, se realizaron análisis filogenéticos y comparaciones de gráficos de puntos utilizando las secuencias del genoma completo de los dos fagos aislados y otros 30 fagos pertenecientes a la familia Rountreeviridae (Tabla complementaria 4). Aunque los dos fagos SBSEC se agruparon junto con el fago C1 de Streptococcus, los fagos vB_SbRt-pBovineB21 y vB_SbRt-pBovineS21 se separaron en diferentes sub-ramas como se muestra en la Fig. 7. Análisis filogenéticos adicionales usando proteínas funcionales, incluida la proteína principal de la cápside (Fig. . 1a) y la ADN polimerasa (Fig. 1b complementaria) también revelaron resultados consistentes con el análisis cladístico basado en el genoma. Además, la identidad de nucleótidos promedio estimada usando OrthoANI entre los fagos vB_SbRt-pBovineB21 y vB_SbRt-pBovineS21 fue del 89,8 %, y el mapa de calor resultante sugirió que no había agrupación para los dos fagos SBSEC y el fago C1 de Streptococcus (Fig. 8). En base a estos resultados, los fagos SBSEC recién aislados podrían considerarse como nuevas especies del género Fischettivirus.

Análisis filogenético de los fagos SBSEC aislados basados en el genoma completo secuenciado. El árbol filogenético y el gráfico de puntos indican que ambos fagos se agrupan con el fago C1 de Streptococcus como nuevos miembros del género Fischettivirus. Los cuadros de colores están representados por miembros de la subfamilia Rakietenvirinae (púrpura), subfamilia Sarlesvirinae (verde), género Fischettivirus (amarillo) y género Negarvirus (rosa), respectivamente, pertenecientes a la familia Rountreeviridae. Los fagos utilizados en este estudio están resaltados en negrita. El grupo externo es el fago Lactobacillus KSY1 (DQ535032.1).

Mapa de calor de los fagos SBSEC aislados en este estudio. El mapa dibujado utilizando los valores ANI de 29 genomas, incluidos los fagos SBSEC y Rountreeviridae aislados, demuestra la agrupación basada en la similitud intergenómica. Los fagos usados en este estudio se indican en negrita.

Para evaluar el efecto de los fagos en la formación de biopelículas de SBSEC, se incubó S. ruminicola KCTC 43,306 con diferentes títulos de suspensión de fagos. Los resultados del ensayo de prevención de biopelículas indicaron que ambos fagos en diferentes concentraciones (109, 108, 107, 106 y 105 UFP/mL) redujeron constantemente la biomasa total en comparación con el grupo de control (Fig. 9a y 9b). En vB_SbRt-pBovineB21, la viabilidad de la célula huésped se redujo en 5 log CFU/mL en la biopelícula formada después de 24 h de incubación, alcanzando una reducción máxima de 2 log CFU/mL después de 48 h (Fig. 9c). En vB_SbRt-pBovineS21, se observó una reducción gradual de la formación de biopelículas. Las células viables disminuyeron en 4 log CFU/mL en comparación con el control después de 24 y 48 h de incubación (Fig. 9d). Los efectos líticos de los fagos en las biopelículas y la presencia de células viables también se analizaron utilizando un microscopio de barrido láser confocal (CLSM) y los fagos mostraron el potencial para controlar la biopelícula formada por S. ruminicola (Fig. 9e). La capacidad potencial de prevención de biopelículas de los fagos también se evaluó utilizando un total de otras cinco cepas sensibles a los fagos (S. infantarius subsp. infantarius ATCC BAA-102 T, S. gallolyticus subsp. gallolyticus DSM 16831 T, S. equinus KCCM 90,374, S. ruminicola KCTC 43308 T y L. lactis subespecie lactis KCCM 41572 T) que mostraron una producción de biopelícula relativamente mayor (datos no mostrados). Los resultados indicaron que los fagos vB_SbRt-pBovineB21 y vB_SbRt-pBovineS21 fueron muy eficaces para prevenir la formación de biopelículas de las cinco cepas seleccionadas con una dosis relativamente baja de concentración de fagos (107 PFU/ml) durante 24 h (Fig. 10).

Capacidad de prevención de biopelículas de los fagos SBSEC aislados. Los efectos de los fagos vB_SbRt-pBovineB21 (a) y vB_SbRt-pBovineS21 (b) sobre la biomasa total de la formación de biopelículas a diferentes concentraciones durante 24 y 48 h. Los efectos de los fagos vB_SbRt-pBovineB21 (c) y vB_SbRt-pBovineS21 (d) sobre células bacterianas viables de biopelículas a diferentes concentraciones durante 24 y 48 h. El control era un cultivo bacteriano sin fagos. Cada experimento se realizó de forma independiente por triplicado usando S. ruminicola KCTC 43,306. Los valores marcados con las distintas letras indican diferencias significativas (p < 0,05). ( e ) Imágenes CLSM de biopelícula S. ruminicola KCTC 43,306 tratada con dos fagos aislados (107 PFU / ml) durante 24 y 48 h. La fluorescencia verde observada con Syto 9 en las imágenes indica células vivas. La barra de escala es 100 μM.

Capacidad de prevención de biopelículas de los fagos SBSEC aislados contra las cinco cepas bacterianas utilizadas en este estudio. (a) Los efectos de los fagos vB_SbRt-pBovineB21 y vB_SbRt-pBovineS21 en la biomasa total de la formación de biopelículas a 107 PFU/ml durante 24 h. El control era un cultivo bacteriano sin fagos. Los valores trazados en el gráfico de caja y bigotes usando GraphPad Prism 7 revelaron todos los puntos junto con el mínimo y el máximo. Cada experimento se llevó a cabo de forma independiente por triplicado. (b) Imágenes CLSM de biopelículas de cinco cepas bacterianas seleccionadas tratadas con los dos fagos aislados (107 PFU/mL) durante 24 h. La fluorescencia verde observada con Syto 9 indica células vivas. La barra de escala es 100 μM.

SBSEC es una bacteria comensal que habita en el tracto gastrointestinal de animales y humanos; sin embargo, su proliferación actúa como desencadenante de acidosis subaguda láctica en rumiantes. Además, también se han informado varias especies representativas que se sabe que son patógenas en pacientes con enfermedades infecciosas. Recientemente, nuestro grupo3 propuso un nuevo miembro de SBSEC, S. ruminicola. Sin embargo, poco se sabe sobre la biodiversidad de SBSEC y los fagos que infectan este complejo bacteriano. Este es el primer estudio que informa las propiedades biológicas y genéticas de ambos fagos líticos que infectan SBSEC representativos, lo que conduce al control potencial de la microbiota ruminal (Tabla 2). Los fagos aislados han infectado en gran medida la SBSEC tanto de las cepas de tipo como de los aislados silvestres del rumen21. Curiosamente, los fagos aislados mostraron una amplia actividad lítica contra otras bacterias productoras de ácido láctico, como Lactobacillus spp.22,23 y Lactococcus sp.24, que rápidamente produce ácido láctico en el rumen25. Este resultado sugiere que los fagos recién aislados pueden tener el potencial de prevenir la acumulación excesiva de lactato producido por las bacterias predominantes del rumen durante los trastornos metabólicos.

Las características morfológicas de los fagos SBSEC aislados fueron similares a las del fago C119 de Streptococcus, que anteriormente pertenecía a la familia Podoviridae y actualmente es miembro de Rountreeviridae, según la taxonomía de ICTV20. Además, las características líticas de los fagos SBSEC aislados exhibieron una actividad antibacteriana eficiente contra SBSEC, después de que ambos fagos adsorbieran la bacteria huésped en 15 minutos. El tiempo de latencia, definido como el tiempo entre la adsorción y el inicio de la lisis celular bacteriana, fue de 20 min. Además, el tamaño de la ráfaga, definido como el número de fagos liberados por la célula huésped infectada, fue de 198 a 367,5 UFP por célula infectada. Estos hallazgos indicaron que los fagos aislados mostraron una adsorción rápida, un período de latencia más corto y un tamaño de explosión significativamente mayor que el del fago vB_EfaP_IME195 de Enterococcus con 30 min y aproximadamente 120 UFP/célula26, el fago de Staphylococcus CSA13 con 20 min y aproximadamente 230 UFP/ mL27 en la familia Rountreeviridae, y Streptococcus fago Cp-1 con 50 min y aproximadamente 9 UFP/mL28 en la familia Salasmaviridae.

La estabilidad de los fagos aislados en diversas condiciones ambientales (incluidas las duras), como la temperatura y el pH, es una propiedad importante para usarlos como posibles agentes de biocontrol. Ambos fagos SBSEC aislados fueron relativamente estables entre 4 y 45 °C, lo que sugiere su adaptación a la actividad metabólica en el entorno del rumen a aproximadamente 38 °C29. Además, ambos fagos eran estables a un pH entre 3 y 12, lo que indica una fuerte tolerancia al pH para entornos extremadamente ácidos y alcalinos. Las condiciones de pH para la actividad óptima de las bacterias degradadoras de almidón en el rumen oscilan entre 5,4 y 630, y las condiciones de acidosis subaguda ruminal deben mantenerse entre pH 5,2 y 631. Estos hallazgos son significativos debido a la capacidad de los fagos aislados para sobrevivir a un pH bajo, lo que puede prevenir la acidosis ruminal causada por bacterias productoras de ácido láctico, incluida la SBSEC, en los rumiantes. Además, la estabilidad ambiental de los fagos aislados fue consistente con la del fago de Escherichia coli aislado de heces de ganado, que informó una tolerancia óptima entre 37 y 40 °C y pH 6,3 y 8, respectivamente32. Los efectos bacteriolíticos se mostraron como una reducción de 2 log CFU/ml en 2 h con el MOI más bajo de 0,001 en comparación con el grupo de control. Esto agrava efectivamente la supervivencia de la bacteria huésped a concentraciones muy bajas y es ventajoso para aplicaciones potenciales.

Las características genómicas de ambos fagos SBSEC eran muy similares a las del fago C119 de Streptococcus. Sin embargo, los fagos recién aislados mostraron varias características genómicas diferentes en comparación con el fago C1 y pueden clasificarse como nuevos miembros del género Fischettivirus de la siguiente manera: Primero, el genoma de ambos fagos SBSEC en general demostró una identidad relativamente baja (< 77 %) en el nivel de nucleótidos con una cobertura del 2% y arreglos genómicos distintos en comparación con el fago C1. En segundo lugar, solo la mitad de todos los ORF predichos en ambos fagos SBSEC se anotaron como proteínas hipotéticas. Se predijo que cada una de las tres proteínas (ORF 7, ORF 11 y ORF 20 en el fago vB_SbRt-pBovineB21 y ORF 6, ORF 10 y ORF 20 en el fago vB_SbRt-pBovineS21) codificarían genes asociados al fago. En tercer lugar, ambos fagos SBSEC poseían sistemas de lisis bacteriana similares pero distintos del fago C1. Se ha informado que el fago C1 de Streptococcus posee una nueva lisina, PlyC, compuesta por dos estructuras específicas identificadas como plyCA y plyCB, que codifican dominios catalíticos y de unión a la pared celular, respectivamente19,33,34. Los genomas secuenciados de los fagos recién aislados en este estudio también codificaron dos proteínas putativas cada uno (ORF 11 y ORF 13 en vB_SbRt-pBovineB21; ORF 10 y ORF 12 en vB_SbRt-pBovineS21) con dominios conservados, que se predijo que serían plyCA y plyCB. No obstante, los genes predichos mostraron baja homología y distinción de disposición con el fago C1 (Fig. 6). Estos resultados revelaron que los fagos SBSEC recién aislados tienen sistemas de lisis diferentes a los del fago C1. Por lo tanto, se requieren estudios adicionales sobre las características detalladas de la actividad potencial de las enzimas asociadas a la lisina derivadas de los fagos aislados para confirmar su singularidad en nuestro análisis futuro.

Hasta la fecha, se sabe poco sobre la presencia y el papel exacto de las biopelículas causadas por SBSEC. Varias cepas de S. galloyticus, incluidas tres subespecies conocidas como patógenos causantes de endocarditis infecciosa, tienen una mayor capacidad de formación de biopelículas y están significativamente asociadas con la resistencia a los antibióticos35,36. Sin embargo, las capacidades de producción de biopelículas de algunas cepas de S. lutetiensis y S. infantarius subsp. infantarius aislado de productos lácteos podría considerarse una característica ventajosa36. Al igual que las cepas SBSEC antes mencionadas, la cepa huésped KCTC 43,306 podría producir biopelículas y pudimos confirmar la presencia de actividad anti-biopelículas en los fagos aislados que pueden reducir de manera eficiente la formación de biopelículas y las células bacterianas viables en las biopelículas. Curiosamente, la formación de biopelículas de cinco cepas de SBSEC y L. lactic subsp. lactis también fue impedida por la inoculación de fagos (Fig. 10). Un estudio informó que el fago que fue eficiente en la reducción de biopelículas tenía un rango de huéspedes más amplio que los que infectaban las propias células bacterianas37, lo que sugiere que los fagos SBSEC recién aislados tendrán un gran potencial para controlar la formación de biopelículas de especies bacterianas más diversas en el rumen. . Por lo tanto, los fagos SBSEC aislados podrían reconocerse como aquellos con potencial antibiopelícula y eficacia en la prevención de biopelículas de bacterias productoras de ácido láctico. Según los genomas de los fagos recién aislados, la despolimerasa derivada de fagos no se ha identificado directamente como una enzima que controle específicamente la formación de biopelículas bacterianas. Sin embargo, las proteínas de la cola codificadas en los genomas de los fagos vB_SbRt-pBovineB21 (ORF 14 y ORF 16) y vB_SbRt-pBovineS21 (ORF 13 y ORF 16) pueden ser despolimerasas putativas, que se han encontrado en la proteína de la fibra de la cola o en la proteína de la espiga de la cola38 ,39. En consecuencia, se justifican más estudios para investigar los mecanismos detallados de la actividad antibiopelícula de los fagos en nuestro análisis futuro. Este es, hasta donde sabemos, el primer estudio que informa las propiedades biológicas y genéticas de los fagos líticos que infectan a los representantes de SBSEC, lo que resulta en un potencial para controlar la microbiota ruminal (Tabla 2).

Este estudio proporciona información biológica y genética sobre dos nuevos fagos líticos (vB_SbRt-pBovineB21 y vB_SbRt-pBovineS21) que infectan varias especies (o subespecies) de SBSEC ruminal. En base a sus propiedades morfológicas y genéticas, ambos fagos pueden ser asignados como nuevas especies de Fischettivirus. Además, los análisis comparativos del genoma revelaron su singularidad en comparación con otros fagos de Streptococcus conocidos. La amplia actividad lítica de los fagos aislados reveló su potencial como agentes de biocontrol contra SBSEC y bacterias productoras de ácido láctico que causan trastornos metabólicos en animales y humanos. En resumen, los fagos recién aislados pueden mejorar la seguridad y la estabilidad de la microbiota ruminal como agentes de biocontrol alternativos.

En total, 59 cepas SBSEC (51 aislados y 8 cepas), S. agalactiae KCCM 11957 T, Lactobacillus plantarum subsp. plantarum KCTC 3108 T, Lactobacillus sakei KCCM 40264 T, Lactobacillus casei KCCM12452T y Lactococcus lactis subsp. lactis KCCM 41572 T se utilizaron en este estudio, como se indica en la Tabla 1. Entre las 59 cepas SBSEC utilizadas en este estudio, 51 se identificaron previamente como miembros de SBSEC según el análisis de la secuencia del gen sodA y se determinó su diversidad genética potencial21. Todas las cepas se cultivaron en agar soja tríptico (TSA; Difco, EE. UU.) a 37 °C durante 24 h y se almacenaron en caldo de soja tríptico (TSB; Difco, EE. UU.) con glicerol al 10 % a -80 °C hasta su uso.

La cepa bacteriana huésped utilizada para el aislamiento de fagos en este estudio fue S. ruminicola KCTC 43,306, que recientemente se informó como una nueva SBSEC3. Se recogieron muestras de heces y aguas residuales bovinas para aislar los fagos SBSEC. Brevemente, la cepa huésped cultivada en fase exponencial en TSB se cocultivó con cantidades iguales de las muestras recolectadas a 37 °C durante 24 h con agitación. Las mezclas se centrifugaron a 10.000 × g durante 20 min y se filtraron con un filtro de jeringa de 0,45 μm (Millex, Merck Millipore Ltd., Irlanda). Se prepararon diluciones seriadas del filtrado en agua destilada y se sembraron en agar blando TSB al 0,7 % que contenía 1 ml de cultivo de la cepa huésped con una DO 600 nm de 0,3. Este proceso se repitió al menos tres veces para obtener placas individuales. A partir de entonces, los fagos bien aislados se propagaron utilizando el método de agar de doble capa convencional40 y se almacenaron a 4 °C hasta su uso.

La morfología de los fagos SBSEC aislados se examinó mediante microscopía electrónica de transmisión. Para la tinción negativa, las partículas de fago propagadas (aproximadamente 109 UFP/mL) se colocaron en rejillas de cobre recubiertas de carbono descargadas luminiscentes y se dejaron absorber durante 2 minutos a temperatura ambiente para la tinción negativa. Las muestras se tiñeron negativamente con una solución de acetato de uranilo (UrAc; Electron Microscopy Sciences, Inc., EE. UU.) al 2 % (p/v) durante 1 min, seguido de la eliminación de UrAc y luego se observaron utilizando un sistema EM de Bio-Alto voltaje. (JEM-1400 Plus; JEOL Ltd., Japón) a un voltaje de aceleración de 120 kV en el Instituto de Ciencias Básicas de Corea (KBSI).

Para determinar el rango de huéspedes de los fagos SBSEC aislados, 60 Streptococcus spp., tres cepas de Lactobacillus sp. y una de Lactococcus sp. se probaron utilizando el método de agar de doble capa y el ensayo puntual. Brevemente, se colocaron 10 µl de lisados de fago (aproximadamente 109 UFP/ml) en una placa de agar de doble capa y se añadieron a 1 ml del cultivo de la cepa bacteriana. Después de la incubación a 37 °C durante 24 h, se observó la formación de zonas de lisis en la placa.

El ensayo de adsorción se realizó como se describió previamente41. Se incubó a 37 °C una mezcla 1:1 de la cepa bacteriana huésped en fase exponencial (aproximadamente 108 CFU/mL) y lisados de fago a una MOI de 0,0001. Se recogieron muestras (100 µl) a los 0, 5, 10, 13, 15, 17, 20 y 25 min después de la inoculación del fago y se centrifugaron a 12 000 × g a 4 °C durante 5 min. Para determinar la proporción de fagos libres, los sobrenadantes se cultivaron por triplicado utilizando el método de agar de doble capa. Se realizó un ensayo de crecimiento de un solo paso para determinar el tiempo de latencia y el tamaño de la explosión, como se describió anteriormente41. Los lisados de fago a una MOI de 0,0001 y la cepa huésped en la fase logarítmica (aproximadamente 108 CFU/mL) se cocultivaron en cantidades iguales a 37 °C durante 15 min, lo que permitió la adsorción al huésped. El sobrenadante se eliminó después de centrifugar a 12 000 × g y 4 °C durante 5 min. Los sedimentos restantes se volvieron a suspender en 10 ml de TSB precalentado y se incubaron a 37 °C con agitación. Se recogieron suspensiones (100 µL) a los 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 y 100 min y se diluyeron inmediatamente con agua destilada para el método de agar de doble capa. por triplicado.

Para la prueba de estabilidad térmica de los fagos SBSEC aislados, se mezclaron 100 µL de lisado de fago (aproximadamente 108 UFP/mL) con 900 µL de PBS 0,1 M (pH 7,0) y se incubaron estáticamente a 4, 16, 25, 37, 45, 56 y 80 °C durante 3 h. Para la prueba de estabilidad del pH, se agregaron 100 µL de lisado de fago (aproximadamente 108 UFP/mL) a una serie de tubos que contenían 900 µL de solución tampón de pH (Samchun Chemicals, Corea) a pH 2, 3, 4, 4,6, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12 y se incubaron a 4 °C durante 3 h. Después de incubar todas las muestras de prueba, se determinó el título de fagos por triplicado utilizando el método de agar de doble capa.

Para evaluar los efectos bacteriolíticos de fagos SBSEC aislados contra SBSEC, se realizaron pruebas de lisis de células huésped como se informó anteriormente42. Se inoculó TSB (10 ml) con la cepa huésped y se incubó a 37 °C hasta que se alcanzó la fase logarítmica. El cultivo se inoculó con lisados de fago a MOI de 0,001, 0,01, 0,1, 1 y 10 a 37 °C durante 24 h con agitación, y el control positivo se usó como un MOI de 0. La absorbancia se determinó midiendo la DO 600 nm cada 1 h durante 10 h, que se realizó por triplicado.

El ADN genómico total extraído por Macrogen (Seúl, Corea) se secuenció en la plataforma Illumina HiSeq X-10 (Illumina, EE. UU.) mediante la construcción de una biblioteca de ADN con el kit de preparación de biblioteca de ADN TruSeq Nano (Illumina, EE. UU.) y se ensambló con SPAdes (ver 3.13.0) ensamblador del genoma43, usando varios k-mers. Los ORF putativos del genoma se anotaron utilizando la anotación rápida del servidor de tecnología de subsistemas (RAST)44. Para determinar la similitud de secuencia, todos los ORF predichos se analizaron utilizando BLASTP45. Los dominios funcionalmente conservados se compararon con proteínas conocidas usando Pfam-A (ver. 35)46 y la base de datos RCSB PDB47 a través de HHpred48. Los dominios transmembrana se predijeron mediante TMHMM 2.049 y los péptidos señal se analizaron mediante SignalP (ver. 6.0)50. PhageTerm51 se realizó utilizando el servidor Galaxy para determinar los extremos del fago y el mecanismo de empaquetamiento. Los genomas de los fagos SBSEC aislados se examinaron en busca de tRNA utilizando tRNAscan-SE 2.052. Además, los genes de virulencia y resistencia a los antibióticos se detectaron mediante la base de datos de factores de virulencia de bacterias patógenas (VFDB)53 y la ANNOTación de genes de resistencia a los antibióticos (ARG-ANNOT)54.

Los mapas del genoma de los fagos SBSEC aislados se visualizaron utilizando CGView Server55. Se construyó un árbol filogenético basado en los genomas disponibles de fagos SBSEC aislados con las cepas de la familia Rountreeviridae en GenBank utilizando el sistema de recursos en línea de clasificación de virus y construcción de árboles56 y el método de filogenia a distancia Genome-BLAST57. El soporte de las ramas del árbol se infirió usando FastME (ver. 2.1.6.1)58 posprocesamiento para las fórmulas D0. Las secuencias de aminoácidos que codifican la principal proteína de la cápside y la ADN polimerasa se alinearon usando Clustal X (ver. 2.1)59 y BioEdit (ver. 7.1.0.3)60 y se construyó un único árbol filogenético usando el método de máxima verosimilitud (ML) en MEGA X61. Los valores de Bootstrap se calcularon para 100 repeticiones. Se generó un diagrama de puntos de las secuencias del genoma usando Gepard 2.1 usando la configuración predeterminada62. OrthoANI63 se utilizó para calcular los valores promedio de identidad de nucleótidos (ANI) de 30 cepas de fagos pertenecientes a la familia Rountreeviridae en la base de datos GenBank. Se generó un mapa de calor basado en los valores ANI usando el mapa de calor del paquete R (ver. 4.1.2)64. El análisis comparativo de fagos SBSEC aislados estrechamente relacionados con el fago C1 de Streptococcus se realizó utilizando Easyfig65.

La eficacia de los fagos SBSEC aislados para prevenir la formación de biopelículas por parte de la cepa huésped se evaluó como se informó anteriormente41. Se utilizó caldo TSB suplementado con sacarosa al 1 % y CaCl2 al 1 % a una concentración de 0,1 M (TSBs-CaCl2) para realizar estos ensayos, ya que ayuda a la formación de biopelículas. Las cepas hospedantes cultivadas durante la noche (aproximadamente 108 CFU/mL) se diluyeron 1:100 con TSBs-CaCl2, y se mezclaron alícuotas de 100 µL de este cultivo diluido con lisado de fago a diferentes concentraciones (105, 106, 107, 108 y 109 PFU/ ml) en cantidades iguales. Las mezclas se añadieron a cada pocillo de una placa estéril de 96 pocillos de fondo plano (SPL Life Sciences, Corea) y se incubaron a 37 °C durante 24 y 48 h. TSB sin fago fue el control negativo. A continuación, el sobrenadante de las placas se lavó tres veces con agua destilada para eliminar las células planctónicas y las biopelículas formadas en cada pocillo se tiñeron con cristal violeta al 0,1 % (CV; Sigma, Reino Unido) durante 20 min a temperatura ambiente. El CV de cada pocillo se lavó y disolvió en 100 µL de etanol, y la DO se midió a 595 nm utilizando un lector de microplacas (Spectramax 190, Molecular Devices, EE. UU.). Las UFC se determinaron utilizando diluciones en serie de agua destilada resuspendida para contar las células bacterianas viables en la biopelícula. La eficacia de los fagos SBSEC aislados para prevenir la formación de biopelículas por otras cepas sensibles a los fagos también se evaluó utilizando una concentración única de lisado de fagos (107 PFU/mL) y los resultados se analizaron mediante incubación a 37 °C durante 24 h.

La capacidad de prevención de biopelículas de los fagos SBSEC aislados se observó mediante imágenes utilizando CLSM (LSM 800 META, Zeiss, Alemania). La biopelícula tratada con cada fago (106 UFP/ml) en comparación con el fago no tratado se cultivó en cubreobjetos estériles (Marienfeld-Superior, Alemania) colocados en placas de seis pocillos sin tratamiento superficial (SPL life sciences, Corea) a 37 ° C por 24 y 48 h. Las biopelículas formadas se tiñeron con Syto 9 (BacLight, Thermo Fisher, EE. UU.) durante 20 min en la oscuridad. Las biopelículas teñidas de cada pocillo se montaron en el portaobjetos (Marienfeld-Superior, Alemania). Los recuentos de células vivas que emiten fluorescencia verde se detectaron mediante excitación a 488 nm y emisión a 498 nm y se visualizaron con un objetivo de 10 × utilizando CLSM.

Los análisis estadísticos se realizaron con GraphPad Prism 7 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EE. UU.) para realizar comparaciones de dos grupos con la prueba t de Student y comparaciones multigrupo con análisis de varianza bidireccional (ANOVA) con la prueba de Tukey. . El nivel de significación se fijó en p < 0,05 (*).

Las secuencias genómicas completas de los fagos SBSEC aislados se han depositado en GenBank con los números de acceso ON759209 (fago vB_SbRt-pBovineB21) y ON759210 (fago vB_SbRt-pBovineS21). El fago SBSEC vB_SbRt-pBovineB21 se depositó en KCCM bajo KCCM13031P, y vB_SbRt-pBovineS21 se depositó en KCTC bajo KCTC 4834.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado y sus archivos de información complementaria. Las secuencias genómicas completas de los fagos SBSEC aislados se han depositado en GenBank con los números de acceso ON759209 (fago vB_SbRt-pBovineB21) y ON759210 (fago vB_SbRt-pBovineS21).

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Esta investigación fue apoyada por el fondo de investigación de la Universidad de Gachon de 2022 (GCU-202110530001) y por el desarrollo de tecnología para la biomaterialización de subproductos de la pesca marina del Instituto Coreano de Promoción de Ciencias y Tecnologías Marinas (KIMST) financiado por el Ministerio de Océanos y Pesca (KIMST-20220128).

Estos autores contribuyeron por igual: Seon Young Park y Hyemin Kwon.

División de Ciencias Animales y Lácteas, Facultad de Agricultura y Ciencias de la Vida, Universidad Nacional de Chungnam, Daejeon, 34134, Corea del Sur

Parque Seon Young y Seongwon Seo

Departamento de Microbiología y Biología Molecular, Facultad de Biociencia y Biotecnología, Universidad Nacional de Chungnam, Daejeon, 34134, Corea del Sur

hyemin kwon

Laboratorio de Biomedicina Acuática, Facultad de Medicina Veterinaria e Instituto de Investigación de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional de Seúl, Seúl, 08826, Corea del Sur

Parque Sang Guen Kim y Se Chang

Departamento de Ciencia y Biotecnología de los Alimentos, Facultad de Tecnología de Bionano, Universidad de Gachon, Seongnam, 13120, Corea del Sur

Ji Hyun Kim

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SYP, JHK y SS concibieron la idea del manuscrito, SGK y SCP participaron en los experimentos biológicos. SYP, HK y JHK prepararon las muestras y realizaron experimentos biológicos. SYP y SS fueron los principales responsables de la preparación del manuscrito. HK realizó el análisis estadístico. SGK, JHK y SCP concibieron el estudio y ayudaron a redactar el manuscrito. Todos los autores revisaron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Ji Hyung Kim o Seongwon Seo.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Park, SY, Kwon, H., Kim, SG et al. Caracterización de dos bacteriófagos líticos que infectan el complejo Streptococcus bovis/equinus (SBSEC) de rumiantes coreanos. Informe científico 13, 9110 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36306-x

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Recibido: 17 febrero 2023

Aceptado: 31 de mayo de 2023

Publicado: 05 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36306-x

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